BATF和TIPE2在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中的表達及意義.pdf

1、第一部分:慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者BATF高表達與Th17免疫反應增強的相關性研究
　　研究背景：
　　乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)是一種嗜肝的非細胞毒性DNA病毒。目前全球約有3.5億至4億慢性HBV感染者，其中部分患者在促發(fā)因素的作用下，病情急性加重，迅速進展為慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronichepatitis Bliver failure，ACHBLF)。ACHBL

2、F是指在慢性HBV感染的基礎上，肝功能急劇、嚴重惡化，患者臨床表現(xiàn)以黃疸和凝血障礙為主，并于4周內出現(xiàn)腹水和/或肝性腦病。宿主和病毒雙重因素的協(xié)同作用決定ACHBLF的疾病進展，其中免疫因素逐漸被重視，在ACHBLF的疾病過程中起到關鍵作用。我們的前期研究檢測了輔助性T淋巴細胞17(Th17)細胞亞群在ACHBLF發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者Th17細胞亞群比例增加，其效應細胞因子白細胞介素-17(IL-17)增多，Th1

3、7免疫反應增強與患者病情進展和預后明顯相關。我們進一步探討了Th17細胞增多的可能原因，發(fā)現(xiàn)堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子ATF樣蛋白(basic leucinezipper transcription factor,ATF-like，BATF)可能是調節(jié)慢加急性乙型肝炎肝衰竭Th17免疫反應的分子靶標。BATF屬于激活蛋白-1轉錄因子超家族，在多種免疫細胞的分化發(fā)育和免疫球蛋白類別轉換中發(fā)揮了重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，BATF是調控Th17細

4、胞增殖分化和IL-17產生的關鍵因素，介導疾病免疫損傷。然而，ACHBLF患者體內BATF表達的變化及其與Th17免疫應答的關系尚不清楚。
　　研究目的：
　　1.探討ACHBLF患者外周血BATF基因和蛋白表達水平的變化;
　　2.探討ACHBLF患者BATF表達水平與肝臟炎癥損傷程度以及Th17免疫應答的關系。
　　研究方法：
　　本研究共納入22例ACHBLF患者，60例慢性乙型肝炎(chronic

5、hepatitisB，CHB)患者以及17例健康對照作為研究對象。應用熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測ACHBLF患者、CHB患者及健康對照外周血單個核細胞(peripheral blood mononu clearcells，PBMCs)中BATF及IL-17、IFN-γ、RORγt和T-betmRNA表達水平;采用流式細胞術檢測外周血CD3+BAT

6、F+T細胞及Th1、Th17和Tc1細胞比例。另外收集了26例行經皮肝穿刺活檢術的CHB患者及6例健康肝移植供者的肝組織，應用免疫組化方法檢測BATF在肝組織內的表達及定位。
　　研究結果：
　　1.ACHBLF患者PBMCs中BATFmRNA表達明顯高于健康對照和CHB患者（P＜0.01，P＜0.05），CHB患者BATFmRNA表達較健康對照也明顯增高（P＜0.01）。
　　2.ACHBLF患者PBMCs中BATF

7、mRNA水平與患者總膽紅素水平呈正相關（r=0.477，P=0.025）;CHB患者BATFmRNA水平與患者谷丙轉氨酶水平、HBV-DNA病毒量呈正相關(r=0.497，P＜0.001;r=0.340，P=0.008)。
　　3.ACHBLF患者外周血CD3+BATF+細胞比例明顯高于健康對照和CHB患者（P＜0.01，P＜0.01），CHB患者CD3+BATF+細胞比例也較健康對照增高(P＜0.01)。三組研究對象CD3+T細

8、胞中BATF蛋白平均熒光強度也表現(xiàn)出相同的變化趨勢(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)。
　　4.ACHBLF患者和CHB患者外周血CD3+BATF+T細胞比例與Th17細胞比例呈正相關(r=0.338，P=0.002);外周血單個核細胞中Th17細胞效應細胞因子IL-17及轉錄因子RORγtmRNA水平也與CD3+BATF+T細胞比例呈明顯正相關(r=0.303，P=0.006;r=0.256，P=0.020)。

9、　　5.BATF陽性細胞在CHB患者肝臟門脈區(qū)聚集。與健康對照相比，CHB患者肝臟浸潤BATF陽性細胞明顯增多(P＜0.01)，并且BATF陽性細胞數(shù)目隨肝臟炎癥程度增高而增多(P＜0.05)。另外，11例應用抗病毒藥物治療6個月后出現(xiàn)生物學應答和病毒性應答的CHB患者中，治療后外周血單個核細胞BATFmRNA水平較治療前明顯降低(P=0.01)。
　　結論：
　　ACHBLF患者、CHB患者外周血和肝組織內BATF表達明顯

10、增高，并且與肝臟炎癥損傷程度相關，提示BATF在HBV感染慢性化和重癥化中均發(fā)揮作用?；颊連ATF表達水平與Th17免疫應答強度正相關，BATF可能通過上調Th17免疫反應，參與介導肝臟免疫損傷。
　　第二部分:TIPE2在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血單個核細胞中的表達及其與疾病預后的關系
　　研究背景：
　　免疫負調控分子表達異常是ACHBLF免疫穩(wěn)態(tài)失衡的另一重要原因。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者出現(xiàn)“免

11、疫麻痹”。這種免疫抑制由多種免疫調節(jié)分子和調節(jié)性免疫細胞參與介導，可能是機體對早期過度促炎癥反應的拮抗效應。腫瘤壞死因子-α誘導蛋白8型-2(tumornecrosisfactor-α-inducedprotein8-like2，TNFAIP8L-2，TIPE2)是最近發(fā)現(xiàn)的一種免疫調控分子，主要表達于免疫器官和淋巴組織中，不同發(fā)育階段的巨噬細胞、T細胞和B細胞中均有TIPE2表達。TIPE2基因缺陷細胞表現(xiàn)出對T細胞受體和Toll樣受

12、體信號活化的高反應性，說明TIPE2可以負性調節(jié)固有免疫和適應性免疫反應。TIPE2的正常表達是阻止免疫反應過激和維持免疫穩(wěn)態(tài)所必需的。研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和慢性乙型肝炎等免疫炎癥疾病中具有重要作用。TIPE2參與HBV引起的肝臟免疫損傷，但TIPE2在ACHBLF患者中的表達改變及意義目前尚無研究。
　　研究目的：
　　1.探討ACHBLF患者外周血單個核細胞中TIPE2mRNA的表達改變，以及TIPE2與

13、ACHBLF病情嚴重程度和疾病預后的關系;
　　2.初步探討TIPE2影響ACHBLF病情發(fā)展的作用機制。
　　研究方法：
　　本研究共納入56例ACHBLF患者，60例CHB患者和24例健康對照者。我們對ACHBLF患者進行了3個月隨訪，根據(jù)患者3個月后的生存情況將患者分為存活組和死亡組。通過密度梯度離心法提取研究對象外周血單個核細胞，Trizol提取總RNA，采用RT-PCR法檢測PBMCs中TIPE2mRNA的相

14、對表達水平。另外，體外培養(yǎng)外周血單個核細胞，檢測應用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后單個核細胞中TIPE2、IL-6和TNF-αmRNA的表達水平。促炎細胞因子IL-6和TNF-α是單個核細胞分泌的主要細胞因子，其體外分泌水平被認為可以代表機體細胞免疫水平。
　　研究結果：
　　1.ACHBLF患者PBMCs中TIPE2mRNA水平明顯高于健康對照組(P＜0.05)和CHB患者（P＜0.01）。與

15、健康對照相比，CHB患者TIPE2mRNA水平降低(P＜0.05)。
　　2.ACHBLF患者TIPE2mRNA表達水平與患者總膽紅素水平(r=0.300，P=0.024)、凝血酶原時間的國際標準化比值（r=0.301，P=0.024）和終末期肝病模型積分（r=0.335，P=0.011）呈明顯正相關關系，與谷丙轉氨酶、白蛋白、肌酐水平、凝血酶原活動度、HBV-DNA病毒量和HBeAg均不具有相關性。
　　3.ACHBLF死

16、亡組患者TIPE2表達明顯高于存活組患者（P＜0.01）。用TIPE2預測ACHBLF患者預后，其受試者工作特征曲線下面積為0.721(95％CI0.572-0.870)。我們進一步研究了ACHBLF患者TIPE2表達的動態(tài)改變。收集32例ACHBLF患者入院第二天、第一周、第二周和第三周的連續(xù)血樣標本，研究發(fā)現(xiàn)，18例存活患者入院三周內PBMCsTIPE2表達隨病情好轉降低，而14例死亡患者TIPE2表達不降反而升高。
　　4.

17、TIPE2與ACHBLF患者細胞免疫功能下降有關。與健康對照和CHB患者相比，ACHBLF患者體外刺激的單個核細胞TIPE2mRNA表達水平明顯增高（P均＜0.05），相反，IL-6和TNF-αmRNA的表達水平明顯降低（P均＜0.05），在死亡組ACHBLF患者中這種趨勢更為明顯。另外，LPS刺激后外周血單個核細胞中TIPE2與TNF-α的表達呈負相關（r=-0.337，P=0.048）。
　　結論:
　　TIPE2在慢性