HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者的血小板減少.pdf

1、背景:
　　乙型肝炎病毒感染(hepatitis B virus，HBV)是當(dāng)前全球慢性肝病的最主要原因，也是全世界的健康威脅。全球大約有20億人曾經(jīng)感染過(guò)HBV，其中3.5億人是慢性HBV感染。全球每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝癌。2006年全國(guó)乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)慢性HBV病毒感染者為9300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者約2000萬(wàn)例。我國(guó)屬HBV感染中流行區(qū)，每年約有1％的

2、乙型肝炎患者進(jìn)展為肝衰竭。肝功能衰竭是一種由于各種因素導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，出現(xiàn)腹水、黃疸、肝性腦病和凝血功能障礙為主要表現(xiàn)的肝臟疾病，其臨床癥狀復(fù)雜，進(jìn)展迅速，病死率高，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅人類健康。我國(guó)肝衰竭最常見(jiàn)的類型是慢加急性肝衰竭(actue onchronic liver failure，ACLF)，而HBV相關(guān)ACLF占總ACLF的80％以上。
　　在慢性肝病患者中，血小板減少（PLT計(jì)數(shù)＜150，000/μl）是一個(gè)常見(jiàn)的

3、現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，在肝硬化患者當(dāng)中，約占76％。我們?cè)诟嗡ソ呋颊咧型馨l(fā)現(xiàn)更嚴(yán)重的血小板減少。由于血小板減少，易發(fā)生出血等并發(fā)癥，而導(dǎo)致患者住院時(shí)間延長(zhǎng)、住院費(fèi)用增加等。引起肝病患者血小板減少的因素是多方面的，如促血小板生成素活性減低，血小板脾臟滯留，慢性HCV感染引起骨髓抑制，抗病毒的干擾素治療，血小板破壞增多等。
　　本實(shí)驗(yàn)研究中，我們描述了HBV相關(guān)慢加急肝衰竭患者血小板計(jì)數(shù)的臨床特征，探尋了血小板計(jì)數(shù)與患者預(yù)后的關(guān)系，對(duì)影響

4、肝衰竭患者血小板計(jì)數(shù)的多重因素進(jìn)行分析，以尋找出引起血小板減少的主要原因。
　　目的:
　　1.描述HBV相關(guān)慢加急肝衰竭患者血小板計(jì)數(shù)特征及動(dòng)態(tài)變化。
　　2.探討慢性肝病患者血小板計(jì)數(shù)與短期死亡率的關(guān)系。
　　3.研究HBV相關(guān)慢加急性肝功能衰竭患者血小板變化模式與預(yù)后的關(guān)系。
　　4.對(duì)慢性肝病患者血小板減少的相關(guān)危險(xiǎn)因素指標(biāo)進(jìn)行比較。
　　5.對(duì)影響血小板計(jì)數(shù)的指標(biāo)進(jìn)行多因素分析，建立數(shù)學(xué)模型

5、，分析引起血小板減少的主要因素。
　　方法:
　　1.納入在南方醫(yī)院肝病中心住院（2011年12月到2014年8月）的慢性乙型病毒性肝炎(CHB)、HBV相關(guān)肝硬化(LC)、HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭(ACLF)患者。納入標(biāo)準(zhǔn):診斷分別符合慢性乙型肝炎診療指南（2010版）、肝衰竭診治指南（2012版），肝硬化的診斷基于肝臟病理活檢或者實(shí)驗(yàn)室檢查、肝臟影像學(xué)及出現(xiàn)門(mén)脈高壓的癥狀（如脾大、腹水、食管靜脈曲張等表現(xiàn)）。排除標(biāo)準(zhǔn):1

6、）、入院前或住院期間已診斷為原發(fā)性肝細(xì)胞癌或接受肝臟移植的病人;2）、合并血液系統(tǒng)惡性疾病，如血液腫瘤、骨髓抑制、或使用具有骨髓抑制的藥物者;3）、入院前，有明確出血事件或輸血史者;4）、合并有其他類型肝病病史者;5）、6個(gè)月內(nèi)有使用影響血小板計(jì)數(shù)的藥物或毒物;6）、既往接受過(guò)脾臟切除術(shù);
　　2.收集患者的基礎(chǔ)資料和臨床檢測(cè)指標(biāo)，腹部B型超聲或CT檢查脾臟厚度及肝硬化情況。每個(gè)患者的臨床檢測(cè)指標(biāo)，包含血小板計(jì)數(shù)，生物化學(xué)指標(biāo)（谷

7、丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、白蛋白等），凝血指標(biāo)（纖維蛋白原、PT-INR、D-二聚體）等。檢測(cè)患者網(wǎng)織血小板比率、促血小板生成素水平、血小板活化比率（PAC-1、CD63、CD62p）、糖蕚素、可溶性CD163、凋亡血小板比率等指標(biāo)，對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行單因素和多因素線性回歸分析，尋找引起血小板減少主要因素。收集了患者入院當(dāng)日、入院后一周、最后隨訪三個(gè)時(shí)間點(diǎn)血小板數(shù)值，記錄患者28天生存情況。
　　3.對(duì)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝病中

8、心2011年2月至2015年1月診斷并治療的HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者資料進(jìn)行回顧性分析，納入標(biāo)準(zhǔn):肝衰竭診治指南（2012版）。收集患者第1天、第7天、第15天、第1月、第2月及最后一次隨訪時(shí)間的血小板計(jì)數(shù)水平，進(jìn)行血小板變化模式分組，并通過(guò)電話隨訪了解患者的生存情況，使用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，不同分組患者生存率采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
　　4.制備血小板取患者靜脈血，用枸櫞酸鈉抗凝管，按照1∶9

9、抗凝，125g離心20分鐘，得到富血小板血漿(PRP)，PRP經(jīng)850g離心5分鐘，得到血小板沉淀，用血小板洗液重懸，得到洗滌血小板。同時(shí)采集患者血漿和血清，-20℃凍存。
　　5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)網(wǎng)織血小板運(yùn)用流式細(xì)胞儀和熒光RNA染料噻唑橙檢測(cè)網(wǎng)織血小板，兩個(gè)流式管中均加入充分混勻的全血5μl和CD61 PerCP10μl,其中一個(gè)為實(shí)驗(yàn)管（加1ml0.1％噻唑橙），另外一個(gè)對(duì)照管（加入1mlPBS）。常溫避光，孵育30分鐘后，

10、1200g離心2.5分鐘，用lmlPBS重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)。流式細(xì)胞儀收集至少10000個(gè)血小板。
　　6.活化血小板的流式檢測(cè)5ul抗凝全血加入到每個(gè)流式管中，后加入10μlCD61 PerCP，設(shè)置實(shí)驗(yàn)管3管和對(duì)照管2管，實(shí)驗(yàn)管中分別加入CD62P PE5μl、CD63 PE5.μl、PAC-1 FITC20μl，對(duì)照管中分別加入Mouse lgG PE5μl、RGDS10μl+PAC-1 FITC20μl，室溫避光

11、孵育30分鐘后，加入1mlPBS重懸，1500轉(zhuǎn)，離心5分鐘，重復(fù)1遍，后廢棄上清液。吸取200μl濃度為2％的多聚甲醛加入，2～8℃冰箱保存，在2小時(shí)后進(jìn)行流式檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血小板計(jì)數(shù)臨床特征及短期變化，納入本研究的HBV相關(guān)慢性肝病患者共191例，其中慢乙肝組68例，肝硬化組48例，慢加急性肝功能衰竭組75例。ACLF患者血小板計(jì)數(shù)[98(3-253)10^9/L]較CHB[17

12、2(24-327)10^9/L](P＜0.0001)患者低，而與LC患者[88(22-244)10^9/L]，(P=0.913)相當(dāng)。ACLF患者入院后1周血小板計(jì)數(shù)[71(4-208)10^9/L]較入院當(dāng)天[97(21-267)10^9/L]明顯下降(P＜0.0001)，慢乙肝、肝硬化組血小板計(jì)數(shù)一周內(nèi)無(wú)明顯變化。
　　2.HBV相關(guān)慢性肝病患者入院血小板計(jì)數(shù)與短期死亡率的關(guān)系.ROC曲線結(jié)果顯示，患者入院血小板計(jì)數(shù)具有預(yù)測(cè)2

13、8天死亡的能力:AUROC=0.716(0.6332-0.7988),P＜0.0001。
　　3.將HBV相關(guān)慢加急性肝功能衰竭患者(n=114)按照血小板變化模式分為三組，分別為PLT持續(xù)下降組、PLT下降回升組、PLT低水平組。PLT下降回升組的4周生存率100％，顯著高于PLT持續(xù)下降組47.4％(P＜0.0001)和PLT低水平組64.9％(P=0.001)。PLT持續(xù)下降組、PLT下降回升組、PLT低水平組，長(zhǎng)期生存率為

14、13.2％、95.8％、40.4％。PLT下降回升組的長(zhǎng)期生存率亦顯著高于其余兩組。
　　4.HBV相關(guān)慢性肝病患者之間血小板相關(guān)指標(biāo)的比較，網(wǎng)織血小板比率、促血小板生成素水平(TPO)、血小板活化狀態(tài)(CD62p、CD63)、血小板破壞水平（糖蕚素）、凋亡血小板比率，慢加急性肝功能衰竭組與慢乙肝組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，慢加急性肝功能衰竭患者巨噬細(xì)胞活化水平sCD163(ug/mL)較慢乙肝組(53.3 vs.18.1，P＜

15、0.0001)高，PAC-1(+)陽(yáng)性率3.33(0.1-38.4)較慢乙肝10.7(0.3-64.9)(P=0.002)低。
　　5.引起HBV相關(guān)慢加急性肝功能衰竭患者血小板減少的危險(xiǎn)因素分析。血小板計(jì)數(shù)與與纖維蛋白原水平(Rs=0.478，P＜0.0001)、白蛋白水平(Rs=0.335，P＜0.0001)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平(Rs=0.199，P=0.007)、糖萼素水平(Rs=0.484，P＜0.0001)呈正相關(guān)，與脾臟厚

16、度(Rs=-0.488，P＜0.0001)、PT-INR(Rs=-0.270，P＜0.0001)、總膽紅素水平(Rs=-0.171，P=0.025)、血小板凋亡水平(Rs=-0.251，P=0.027)呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.肝衰竭和肝硬化組血小板計(jì)數(shù)顯著低于慢乙肝組，慢加急性肝功能衰竭患者入院一周內(nèi)血小板下降顯著，而慢乙肝、肝硬化患者無(wú)此變化。
　　2.患者短期死亡率與入院血小板計(jì)數(shù)關(guān)系密切，患者入院時(shí)血小板

17、計(jì)數(shù)可預(yù)測(cè)短期預(yù)后。
　　3.慢加急性肝衰竭患者，血小板下降回升組的短期及長(zhǎng)期生存率均高于持續(xù)下降組和低水平組，血小板的變化模式與患者預(yù)后有著密切的關(guān)系。
　　4.網(wǎng)織血小板比率、TPO水平、CD62(+)比率、CD63(+)比率、糖萼素水平、凋亡血小板比例在慢乙肝組、肝功能衰竭組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示血小板生成、破壞、凋亡比率在這兩組之間差異不大。慢加急性肝衰竭患者脾臟厚度、D-二聚體、PT-INR、sCD163均高于慢