褪黑素對大鼠血糖、血脂代謝和動脈粥樣硬化相關(guān)因素影響及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 褪黑素(melatonin)是一種主要在夜間由松果體合成分泌、受光線明暗及晝夜節(jié)律調(diào)控的吲哚類激素，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗自由基和氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)機體血脂和血糖代謝等多種心血管相關(guān)的生理藥理學(xué)作用。體內(nèi)褪黑素水平的下降與動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生，以及機體的血脂、血糖代謝異常有顯著的相關(guān)性。但機體血清褪黑素水平的改變與機體脂糖代謝異常是否存在因果關(guān)系有待進一步研究。血管內(nèi)皮炎癥在動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重

2、要的作用。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素與血管炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能之間存在一定的相關(guān)性。但褪黑素水平的降低是否可以導(dǎo)致血管炎癥的發(fā)生，其對血管內(nèi)皮細胞炎癥因子表達的調(diào)控及其機制仍有待進一步研究。動脈粥樣硬化病變的典型特征是巨噬細胞吞噬大量的脂質(zhì)，導(dǎo)致泡沫細胞形成。巨噬細胞表面的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ABCG1)及其介導(dǎo)的膽固醇外流是細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運的重要始動因素。研究證實，ABCA1介導(dǎo)細胞內(nèi)膽固醇外流功能

3、障礙能加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，而ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流功能與ABCA1介導(dǎo)的膽固醇外流具有協(xié)同作用。褪黑素能否影響ABCA1和ABCG1的表達及其介導(dǎo)的巨噬細胞膽固醇外流功能，目前未見報道。我們通過建立大鼠去松果體致褪黑素缺乏的動物模型，分別對以上三部分進行研究:
　　 第一部分去松果體致褪黑素缺乏大鼠模型的建立及血糖、血脂代謝特點分析
　　 研究目的:
　　 1.建立去松果體致褪黑素缺乏的大鼠動物模型

4、;
　　 2.觀察在生理性褪黑素缺乏的環(huán)境下大鼠體內(nèi)血脂、血糖代謝的特點;
　　 研究方法:
　　 1.10周齡雄性Wistar大鼠共36只，隨機分為兩組。通過松果體摘除手術(shù)建立大鼠去松果體致褪黑素缺乏的動物模型(Px組)，并以假手術(shù)大鼠作為對照組(Con組)，檢測手術(shù)前后大鼠血清夜間褪黑素水平判斷褪黑素缺乏模型是否成功;
　　 2.在術(shù)前0周，術(shù)后4周、8周、16周四個時間點測量褪黑素缺乏大鼠在正常飲食

5、條件下血脂、血糖相關(guān)代謝指標的水平，分析其隨時間的動態(tài)變化特點;
　　 3.測量術(shù)后16周大鼠肝臟脂質(zhì)水平含量，分析其與血脂水平的關(guān)系;
　　 研究結(jié)果:
　　 1.去松果體組(Px組，N=16)動物夜間褪黑素水平減少至術(shù)前的20％，且顯著低于假手術(shù)對照組(Con組，N=14)(8.19±2.05ng/L和39.98±5.91ng/L，P＜0.01)，褪黑素缺乏模型制作成功;
　　 2.在術(shù)前0周和術(shù)后4

6、周、8周、16周各組大鼠血脂血糖水平分別為:
　　 1)血脂代謝指標:兩組動物血脂基線水平一致。Px組大鼠血清TG、FFA和VLDL-C水平自術(shù)后4周時相比4周Con組大鼠均顯著增高，并持續(xù)增高至16周（P值均＜0.05）。在校正0周基線值后，Px組上述指標的16周相對0周變化值仍較Con組變化值顯著增加（P值均＜0.05）;
　　 2)糖代謝方面，兩組動物血糖和胰島素水平的基線值水平一致。相比術(shù)后16周Con組，術(shù)后1

7、6周Px組大鼠的血糖水平顯著增加(P＜0.05)，ISI指數(shù)的水平顯著降低(P＜0.05)，但INS的的增高無顯著意義。在校正了術(shù)前0周水平后，術(shù)后16周Px組上述陽性指標的變化值相比對照組變化值的差異仍有顯著意義（P值均＜0.05）;
　　 3.Px組大鼠16周肝臟單位質(zhì)量的甘油三酯含量相比16周Con組顯著增加(P＜0.01)，但其單位質(zhì)量的總膽固醇含量兩組間比較無顯著性差異。
　　 第二部分去松果體致褪黑素缺乏大鼠

8、主動脈內(nèi)皮炎癥因子表達的變化及機制
　　 研究目的:
　　 1.研究褪黑素缺乏環(huán)境下大鼠體內(nèi)血清炎癥因子水平的變化，觀察其主動脈內(nèi)皮細胞炎癥因子表達的情況，
　　 2.研究褪黑素對體外培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞炎癥因子表達調(diào)控的作用及相關(guān)信號通路機制;
　　 研究方法:
　　 1.10周齡雄性Wistar大鼠，建立褪黑素缺乏的大鼠模型組（8只），以假手術(shù)組（7只）作為對照（見第一部分）;
　　

9、 2.分別測量褪黑素缺乏大鼠術(shù)前0周和術(shù)后16周時血清氧化應(yīng)激和炎癥標志物MDA、oxLDL、TNFα、IL-6和CRP的水平，檢測大鼠主動脈內(nèi)皮炎癥因子MCP-1、ICAM-1、VCAM-1和MMP-9的表達情況;
　　 3.體外培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞系，用褪黑素干預(yù)oxLDL預(yù)刺激的內(nèi)皮細胞，觀察細胞炎癥因子蛋白表達的變化，同時檢測炎癥相關(guān)信號通路NF-κB、P38-MAPK、.JNK和ERK磷酸化水平的表達，探討褪黑素可

10、能的作用機制;
　　 研究結(jié)果:
　　 1.兩組動物血清炎癥因子基線值水平基本一致。在術(shù)后16周，Px組(N=8)大鼠血清MDA、oxLDL、TNFα、IL-6和CRP水平相比16周Con組(N=7)均顯著增加（P值均＜0.01）。在校正0周基線值后，Px組上述指標的16周相對0周變化值仍較Con組變化值顯著增加（P值均＜0.05）;
　　 2.術(shù)后16周，Px組大鼠主動脈內(nèi)皮MCP-1、VCAM-1和MMP-9

11、因子表達水平的IOD值相比16周Con組對應(yīng)值均顯著增加（P值均＜0.05）。而Px組大鼠16周ICAM-1表達相比Con組無顯著統(tǒng)計學(xué)意義;
　　 3.褪黑素劑量依賴性地顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞表面MCP-1、VCAM-1和MMP-9蛋白表達（P值均＜0.05）;并劑量依賴性地顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)RAEC細胞內(nèi)NF-κB和P38-MAPK通路蛋白磷酸化表達水平（P值均＜0.05），但對JNK和ERK1/2蛋白

12、磷酸化表達水平無顯著影響。
　　 第三部分去松果體致褪黑素缺乏大鼠腹腔巨噬細胞膽固醇外流的變化及機制
　　 研究目的:
　　 1.研究褪黑素缺乏大鼠腹腔巨噬細胞膽固醇外流功能的變化;
　　 2.研究褪黑素缺乏大鼠腹腔巨噬細胞表面ABCA1和ABCG1的表達情況;
　　 3.探討褪黑素對巨噬細胞ABCA1表達的相關(guān)信號調(diào)控機制。
　　 研究方法:
　　 1.10周齡雄性Wistar大

13、鼠，建立褪黑素缺乏的大鼠模型組（共16只），以假手術(shù)組（共16只）作為對照（見第一部分）;
　　 2.分別收集培養(yǎng)大鼠術(shù)前0周和術(shù)后16周的腹腔巨噬細胞，檢測褪黑素缺乏大鼠術(shù)前0周和術(shù)后16周的腹腔巨噬細胞ABCA1、ABCG1和全血清介導(dǎo)的膽固醇外流率，評估不同因素介導(dǎo)外流率的變化;
　　 3.檢測術(shù)后16周腹腔巨噬細胞ABCA1和ABCG1基因和蛋白表達的變化;
　　 4.體外培養(yǎng)人單核細胞系(THP-1)并

14、誘導(dǎo)分化為巨噬細胞，分別以不同濃度褪黑素干預(yù)細胞，觀察其對細胞ABCA1表達的影響并探討其作用的相關(guān)信號通路機制。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.兩組動物腹腔巨噬細胞膽固醇外流率基線值基本一致。Px組(N=6)術(shù)后16周的全血清誘導(dǎo)(-7.29±5.91％和-3.80±4.79％，P＜0.01)以及ABCA1介導(dǎo)的膽固醇外流率相對0周的變化值(-4.21±4.82％和-1.20±2.12％，P＜0.01)相比Con組(N=

15、6)對應(yīng)的變化值均顯著下降，但ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流率的變化值在兩組間無顯著差異。
　　 2.術(shù)后16周，Px組(N=6)的腹腔巨噬細胞ABCA1轉(zhuǎn)運體mRNA水平的表達相比16周Con組(N=6)的表達顯著下降(P＜0.01)，但其蛋白表達水平在兩組間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3.術(shù)后16周，ABCG1轉(zhuǎn)運體mRNA和蛋白水平的表達在兩組間均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4.褪黑素劑量依賴性地顯著增強THP-1

16、巨噬細胞ABCA1和LXRα的mRNA水平和蛋白水平的表達(P值均＜0.05); PPARγ和LXRα拮抗劑均可顯著抑制褪黑素對細胞ABCA1蛋白表達的促進作用（P值均＜0.001）;褪黑素膜受體MT1/MT2拮抗劑對于褪黑素對細胞ABCA1蛋白表達的調(diào)控均無顯著影響。
　　 研究結(jié)論
　　 1.通過松果體摘除手術(shù)成功建立褪黑素缺乏的大鼠動物模型。
　　 2.褪黑素缺乏可顯著導(dǎo)致大鼠胰島素抵抗的發(fā)生，影響大鼠血甘