慢性腎衰對(duì)脂肪組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)的活化及機(jī)制.pdf

1、第一部分慢性腎衰對(duì)脂肪組織腎素—血管緊張素系統(tǒng)的活化及機(jī)制
　　 研究背景:
　　 慢性腎功能不全(CRF)是一種慢性炎癥性疾病，脂肪組織是其炎癥反應(yīng)的一個(gè)主要來(lái)源。脂肪組織不僅是機(jī)體重要的能量?jī)?chǔ)存場(chǎng)所，而且還可以合成和分泌大量的脂肪因子，如細(xì)胞因子、急性期反應(yīng)蛋白、趨化因子等。研究發(fā)現(xiàn):慢性腎功能不全時(shí)，脂肪組織釋放大量的脂肪因子，引起全身炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，進(jìn)而促進(jìn)了慢性腎衰一系列并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 長(zhǎng)期以

2、來(lái)，人們認(rèn)為腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)僅調(diào)節(jié)著收縮壓和腎臟電解質(zhì)的平衡，但近些年研究發(fā)現(xiàn)，腎素—血管緊張素系統(tǒng)的多種成分也表達(dá)于多種組織中，如:腎上腺、腎臟、腦、心臟和血管中。局部RAS可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)、促進(jìn)增生、纖維化及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)局部器官的生理學(xué)功能。自1987年研究發(fā)現(xiàn)大鼠主動(dòng)脈周圍脂肪組織有AGTmRNA的表達(dá)后，大量關(guān)于脂肪組織局部亦表達(dá)RAS的研究開(kāi)展起來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠和人的脂肪組織中表達(dá)合成血管緊張素Ⅱ所需的

3、所有成分，包括血管緊張素原(AGT)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和血管緊張素Ⅰ型受體(AT1)等。進(jìn)一步的研究還證實(shí)，局部RAS可影響脂肪組織的生物學(xué)活性和代謝功能，如:血管緊張素Ⅱ通過(guò)與其受體結(jié)合，可以抑制脂質(zhì)分解和促進(jìn)脂質(zhì)合成，進(jìn)而促進(jìn)了脂肪組織脂質(zhì)的蓄積;血管緊張素Ⅱ抑制前脂肪細(xì)胞的分化，減少脂肪細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的肥大;血管緊張素Ⅱ還促進(jìn)炎癥因子的釋放，引起脂肪組織炎癥反應(yīng)和重塑。局部腎素—血管緊張素系統(tǒng)不僅對(duì)脂肪組織局部

4、發(fā)揮著重要作用，對(duì)機(jī)體全身也產(chǎn)生著巨大影響，如引起脂質(zhì)代謝異常、高血壓、胰島素抵抗和其他部位炎癥性疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥性肺疾病、腎衰竭和腫瘤等。
　　 我們之前的研究已發(fā)現(xiàn)慢性腎衰時(shí)脂肪組織存在明顯的炎癥反應(yīng)，但其具體機(jī)制尚不清楚。為探討脂肪組織的RAS是否參與此過(guò)程，我們首先測(cè)定了慢性腎衰時(shí)脂肪組織RAS的表達(dá)情況。
　　 4—羥基2—壬烯（HNE）是脂質(zhì)過(guò)氧化的終末產(chǎn)物，在終末期腎衰的病人中常升高;本實(shí)驗(yàn)室也

5、已證實(shí)慢性腎衰大鼠皮下和內(nèi)臟脂肪組織高表達(dá)HNE蛋白。脂肪細(xì)胞HNE的蓄積可引起脂聯(lián)素的合成減少及慢性炎癥的發(fā)生。研究證實(shí)，HNE可以促進(jìn)Toll樣受體(TLRs)的表達(dá)，引起一系列的病理改變;終末期腎衰病人單核細(xì)胞和白細(xì)胞中TLRs表達(dá)也增多，那么慢性腎衰時(shí)，HNE是否通過(guò)TLRs引起RAS活化尚不清楚。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，5/6腎切除大鼠作為慢性腎功能衰竭模型，觀察脂肪組織是否存在腎素—血管緊張素系統(tǒng)的活化。目的在于探討慢性腎

6、衰時(shí)脂肪組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制。
　　 體外實(shí)驗(yàn)，用HNE刺激3T3-L1脂肪細(xì)胞，觀察HNE是否可誘導(dǎo)腎素—血管緊張素系統(tǒng)的活化;阻斷TLRs的表達(dá)，觀察HNE刺激RAS的活化是否受抑制，即探討HNE活化RAS的可能機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 體內(nèi)部分:
　　 一、二步法5/6腎切除建立慢性腎衰模型
　　 1)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，俯臥位定于鼠臺(tái)上。
　　

7、 2)酒精消毒，于大鼠左腹部中1/3脊柱旁開(kāi)2-3cm處行縱行切口，切口長(zhǎng)度約為2-3cm。
　　 3)依次切開(kāi)皮膚和皮下組織，并剪開(kāi)肌肉暴露腎臟，剝離腎包膜，用無(wú)損傷血管鉗夾住腎蒂，切除腎臟的上下極約占左腎的2/3，明膠海綿壓緊上下極創(chuàng)面止血，放松血管鉗，觀察創(chuàng)面不再滲血后還納腎臟回腹腔，逐層縫合肌層及皮膚，酒精消毒手術(shù)切口。縫合前，腹腔內(nèi)滴注青霉素注射液，預(yù)防感染。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。
　　 4)一周后，在脊

8、柱右側(cè)中1/3旁開(kāi)2-3cm縱行切口（切口略高于左側(cè)），分離肌層，游離腎臟，無(wú)損傷血管鉗夾住腎蒂，4號(hào)絲線結(jié)扎腎蒂，切除右側(cè)腎臟，觀察有無(wú)出血，縫合肌層和皮膚，酒精消毒手術(shù)切口。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。
　　 二、大鼠血、尿和脂肪組織的留取及處理
　　 1)術(shù)后第16周，測(cè)定大鼠血壓后將大鼠放于代謝籠中，留取24小時(shí)尿。
　　 2)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠臺(tái)上
　

9、　 3)腹主動(dòng)脈采血后，采用放血法處死大鼠。
　　 4)酒精消毒皮膚，分離附睪和腹膜后脂肪墊（內(nèi)臟脂肪）及腹股溝脂肪墊（皮下脂肪），迅速放入盛有1×PBS(PH7.4)的培養(yǎng)皿中。
　　 5)PBS反復(fù)清洗脂肪墊，剔除肉眼可見(jiàn)的血管，將脂肪墊剪成小塊，包于錫箔紙中，液氮速凍，-80℃保存。
　　 三、脂肪組織腎素(—)血管緊張素系統(tǒng)指標(biāo)AT1蛋白活性的檢測(cè)
　　 Sham組和CRF組大鼠皮下和內(nèi)臟脂肪組

10、織，按組織重量:裂解液=1:4的比例用勻漿器反復(fù)上下勻漿，以上操作均在冰上進(jìn)行，勻漿完全后，13000g，4℃離心40min，去掉漂浮于上層的脂滴，提取中間層的勻漿液，即為脂肪組織的總蛋白，加入SDS(5×)上樣緩沖液，95℃煮沸蛋白，Western Blotting檢測(cè)脂肪組織AT1蛋白的活性。
　　 四、real-time PCR檢測(cè)皮下和內(nèi)臟脂肪組織腎素—血管緊張素系統(tǒng)AGT、ACE、AT1的表達(dá)
　　 Sham組

11、和CRF組大鼠皮下和內(nèi)臟脂肪組織液氮砸碎，按組織重量:TRIZOL=1:10的比例勻漿，提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測(cè)AGT、ACE、AT1的表達(dá)。
　　 五、統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。與常數(shù)項(xiàng)比較，采用單樣本t檢驗(yàn);兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 體外部分:

12、>　　 一、3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化
　　 3T3-L1前脂肪細(xì)胞采用美國(guó)ATCC細(xì)胞株。復(fù)蘇后在37℃，5％CO2，10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代。細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合2d后，加含0.5mmol/L異丁基-3-甲基黃嘌呤、0.25umol/L地塞米松、10ug/ml胰島素和10％FBS的含糖DMEM(4.5mg/L)培養(yǎng)48h，隨后以含10％FBS的含糖DMEM(4.5mg

13、/L)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48h換1次培養(yǎng)液，誘導(dǎo)分化8-10d的3T3-L1細(xì)胞95％以上呈脂肪細(xì)胞表型。實(shí)驗(yàn)前改換用不含F(xiàn)BS的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)狀態(tài)，然后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 二、HNE誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞表達(dá)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的時(shí)間、濃度效應(yīng)
　　 脂肪細(xì)胞分別與5、10、20、40umol/L HNE或DMSO共同孵育0、4、8、16、24小時(shí)，收集細(xì)胞提取RNA，qRT-PCR檢測(cè)AGT、ACE

14、、AT1的表達(dá)。
　　 三、TLR2和TLR4siRNA干擾后HNE刺激，脂肪細(xì)胞腎素-血管緊張素系統(tǒng)表達(dá)的測(cè)定
　　 脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第7天，加入TLR2和TLR4siRNA，有效干擾后，加入HNE（40umol/L），16h后收集細(xì)胞，提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)AGT、ACE、AT1的表達(dá)。
　　 四、統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)分析由統(tǒng)計(jì)軟

15、件SPSS13.0完成。與常數(shù)項(xiàng)比較，采用單樣本t檢驗(yàn);方差齊的多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用LSD法;方差不齊的多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用Welch法，兩兩比較采用Dunnett's T3法。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 體內(nèi)部分:
　　 一、腎衰大鼠模型的確立
　　 在二步法5/6腎切除術(shù)后的第16周，采集大鼠尿液和血液測(cè)定血肌酐和肌酐清除率。在第1

16、6周時(shí)，腎衰組大鼠體重和肌酐清除率與假手術(shù)組相比顯著減少(p＜0.001)，而血肌酐和血壓水平顯著升高(p＜0.001)。
　　 二、慢性腎衰對(duì)腎素—血管緊張素系統(tǒng)的影響
　　 1、慢性腎衰促進(jìn)皮下和內(nèi)臟脂肪AGT、ACE、AT1mRNA的表達(dá)
　　 CRF組AGT、ACE、AT1mRNA的表達(dá)水平與假手術(shù)組相比顯著性升高（皮下AGT:t=7.877,p=0.016; ACE:t=9.915,p=0.010; A

17、T1:t=10.757,p=0.009;內(nèi)臟AGT:t=10.459, p=0.009; ACE:t=11.218,p=0.008; AT1:t=12.884,p=0.006)。
　　 2、慢性腎衰促進(jìn)皮下和內(nèi)臟脂肪AT1蛋白的表達(dá)
　　 CRF組AGT、ACE、AT1蛋白的表達(dá)水平與假手術(shù)組相比顯著性升高(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 慢性腎衰大鼠皮下和內(nèi)臟脂肪組織腎素—血管緊張素系統(tǒng)活化。

18、r>　　 體外部分:
　　 一、HNE對(duì)脂肪細(xì)胞腎素—血管緊張素系統(tǒng)表達(dá)的影響
　　 HNE以劑量依賴的方式上調(diào)脂肪細(xì)胞（3T3-L1細(xì)胞）AGT、ACE、AT1m的表達(dá)，并在40umol/L時(shí)達(dá)最高(AGT:F=16.254，p＜0.001，ACE:F=13.486，p＜0.01，AT1:F=14.252，p＜0.001);同時(shí)HNE以時(shí)間依賴的方式上調(diào)3T3-L1細(xì)胞AGT、ACE、AT1mRNA的表達(dá)，刺激16小

19、時(shí)AGT、ACE、AT1mRNA的表達(dá)最高( AGT:F=14.754，p＜0.001，ACE:F=11.837，p＜0.01，AT1:F=13.925，p＜0.001)。
　　 二、TLR2 siRNA對(duì)HNE誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞腎素—血管緊張素系統(tǒng)活化的影響
　　 1、TLR2 siRNA抑制3T3-L1細(xì)胞TLR2受體的表達(dá)
　　 TLR2 siRNA可以有效地抑制3T3-L1細(xì)胞TLR2mRNA和蛋白的表達(dá)(p＜

20、0.05)。
　　 2、TLR2 siRNA抑制了HNE對(duì)3T3-L1細(xì)胞腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性的影響
　　 TLR2 siRNA干擾3T3-L1細(xì)胞后，HNE對(duì)3T3-L1細(xì)胞AGT、ACE、AT1mRNA表達(dá)的上調(diào)作用被抑制(p＜0.05)。
　　 三、TLR4 siRNA抑制HNE誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞腎素—血管緊張素系統(tǒng)指標(biāo)的表達(dá)
　　 1、TLR4 siRNA抑制3T3-L1細(xì)胞TLR4受體的表達(dá)

21、>　　 TLR4 siRNA可以有效地抑制3T3-L1細(xì)胞TLR4mRNA和蛋白的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 2、TLR4 siRNA抑制了HNE對(duì)3T3-L1細(xì)胞腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性的影響
　　 TLR4 siRNA干擾3T3-L1細(xì)胞后，HNE對(duì)3T3-L1細(xì)胞AGT、ACE、AT1mRNA表達(dá)的上調(diào)作用被抑制(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、HNE以時(shí)間劑量依賴方式上調(diào)脂肪細(xì)胞腎素

22、-血管緊張素系統(tǒng)的表達(dá)
　　 2、TLR2和TLR4 siRNA干擾后有效地抑制HNE對(duì)腎素—血管緊張素系統(tǒng)的活化。
　　 總結(jié):
　　 1、慢性腎衰促進(jìn)脂肪組織腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的活化;
　　 2、HNE可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞RAS的活化，并且此過(guò)程可能由TLR2和TLR4介導(dǎo)。
　　 第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑對(duì)慢性腎衰脂肪組織脂質(zhì)分解的影響
　　 研究背景:
　　 許多慢性

23、消耗性疾病常伴有蛋白質(zhì)-能量消耗(PEW)和脂肪組織的減少。蛋白質(zhì)-能量消耗(PEW)主要表現(xiàn)為體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪儲(chǔ)存的減少，以營(yíng)養(yǎng)不良和炎癥為特征，在進(jìn)展性慢性腎病(CKD)中常存在，是CKD病人死亡率增加的重要危險(xiǎn)因素。體內(nèi)脂肪的丟失是CKD病人死亡率增加的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。脂肪細(xì)胞調(diào)節(jié)著能量平衡和機(jī)體脂肪組織的多少。脂質(zhì)分解異常與人類多種疾病密切相關(guān)，如代謝綜合征、肥胖癥、胰島素抵抗、糖尿病、惡病質(zhì)等。已有研究表明，慢性腎功能不全時(shí)

24、脂肪組織的脂質(zhì)分解增加，導(dǎo)致脂質(zhì)存儲(chǔ)和動(dòng)員異常，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。
　　 大量研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)參與了人類多種慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展，如慢性腎臟病、糖尿病、慢性炎癥等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白合成的細(xì)胞器，低氧、低血糖、毒物等能干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成增加而致蛋白過(guò)度負(fù)荷或錯(cuò)誤折疊，未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蓄積引發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response)，統(tǒng)稱為內(nèi)

25、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。各種理化因素通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上三個(gè)應(yīng)激感知蛋白，即PEK樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激轉(zhuǎn)導(dǎo)子IRE1(inositol-requiring kinase1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜轉(zhuǎn)錄因子ATF6而啟動(dòng)UPR反應(yīng)。研究已發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起脂肪細(xì)胞的功能紊亂，如局部炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗及凋亡等。本實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)，慢性腎衰時(shí)主動(dòng)脈上存在著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。那么，慢性腎功能不全時(shí)，脂肪組織是否也存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及

26、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了脂肪組織脂質(zhì)分解還需進(jìn)一步研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)中，以5/6腎切除大鼠作為慢性腎功能衰竭模型，觀察慢性腎衰脂肪組織是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;并應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA刺激慢性腎衰大鼠，觀察其脂質(zhì)分解的變化情況，即探討慢性腎衰時(shí)脂肪組織脂質(zhì)分解增強(qiáng)的機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 一、二步法5/6腎切除建立慢性腎衰模型
　　 1)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，俯臥位定于鼠

27、臺(tái)上。
　　 2)酒精消毒，于大鼠左腹部中1/3脊柱旁開(kāi)2-3cm處行縱行切口，切口長(zhǎng)度約為2-3cm。
　　 3)依次切開(kāi)皮膚和皮下組織，并剪開(kāi)肌肉暴露腎臟，剝離腎包膜，用無(wú)損傷血管鉗夾住腎蒂，切除腎臟的上下極約占左腎的2/3，明膠海綿壓緊上下極創(chuàng)面止血，放松血管鉗，觀察創(chuàng)面不再滲血后還納腎臟回腹腔，逐層縫合肌層及皮膚，酒精消毒手術(shù)切口?？p合前，腹腔內(nèi)滴注青霉素注射液，預(yù)防感染。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。
　　

28、 4)一周后，在脊柱右側(cè)中1/3旁開(kāi)2-3cm縱行切口（切口略高于左側(cè)），分離肌層，游離腎臟，無(wú)損傷血管鉗夾住腎蒂，4號(hào)絲線結(jié)扎腎蒂，切除右側(cè)腎臟，觀察有無(wú)出血，縫合肌層和皮膚，酒精消毒手術(shù)切口。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。
　　 二、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA刺激大鼠
　　 在二期手術(shù)完成后的第12周，將慢性腎衰大鼠隨機(jī)分為三組，第一組不做任何處理，第二組灌PBS，第三組灌PBA(200mg/kg/d)，持續(xù)4周。大鼠處死前

29、一天，測(cè)量血壓。
　　 三、大鼠脂肪組織的提取及甘油的測(cè)定
　　 1)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠臺(tái)上
　　 2)腹主動(dòng)脈采血后，采用放血法處死大鼠。
　　 3)酒精消毒皮膚，分離附睪和腹膜后脂肪墊（內(nèi)臟脂肪）及腹股溝脂肪墊（皮下脂肪），迅速放入盛有1×PBS(PH7.4)的培養(yǎng)皿中，稱重。
　　 4) PBS反復(fù)清洗脂肪墊，剔除肉眼可見(jiàn)的血管，將脂肪墊剪成大

30、小約1-3mm2的脂肪塊，放入含2％無(wú)脂肪酸BSA的KRB磷酸鹽緩沖液中孵育5h，收集孵育液，3000g/min離心5min，測(cè)定甘油含量，以脂肪塊重量校正。
　　 四、皮下和內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2a/eIF2a、p-IRE1a/IRE1a蛋白活性的檢測(cè)
　　 Sham組、CRF組、CRF+Vehicle組和CRF+PBA組大鼠皮下和內(nèi)臟脂肪組織，按組織重量:裂解液=1

31、:4的比例用勻漿器反復(fù)上下勻漿，以上操作均在冰上進(jìn)行，勻漿完全后，13000g，4℃離心40min，去掉漂浮于上層的脂滴，提取中間層的勻漿液，即為脂肪組織的總蛋白，加入SDS(5×)上樣緩沖液，95℃煮沸蛋白，Western Blotting檢測(cè)皮下和內(nèi)臟脂肪組織GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2a/eIF2a、p-IRE1a/IRE1a蛋白的活性。
　　 五、real-time PCR檢測(cè)皮下和內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

32、應(yīng)激指標(biāo)GRP78的表達(dá)
　　 Sham組、CRF組、CRF+Vehicle組和CRF+PBA組大鼠皮下和內(nèi)臟脂肪組織液氮砸碎，按組織重量:TRIZOL=1:10的比例勻漿，提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測(cè)GRP78mRNA的表達(dá)。
　　 六、統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。與常數(shù)項(xiàng)比較，采用單樣本t檢驗(yàn);方差齊的多個(gè)

33、樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用LSD法;方差不齊的多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用Welch法，兩兩比較采用Dunnett's T3法。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、慢性腎衰大鼠模型的確立
　　 在二步法5/6腎切除術(shù)后的第16周測(cè)量各組大鼠的血壓并采血測(cè)定肌酐、尿素氮含量。術(shù)后第16周，CRF組收縮壓、平均動(dòng)脈壓、血肌酐和尿素氮較Sham組均顯著升高(p＜0.05)

34、，而CRF組體重比Sham組減輕(p＜0.05)。CRF+PBA組的血肌酐和尿素氮與CRF+Vehicle組相比無(wú)明顯差異(p＞0.05)，但收縮壓和平均動(dòng)脈壓較CRF+Vehicle組有所下降(p＜0.05)，而體重較CRF+Vehicle組升高(p＜0.05)
　　 二、PBA抑制慢性腎衰誘導(dǎo)的皮下和內(nèi)臟脂肪的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　 1、慢性腎衰皮下脂肪內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表達(dá)情況
　　 (1)慢性腎衰皮下脂肪GRP78m

35、RNA的表達(dá)
　　 CRF組GRP78mRNA的表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。
　　 (2)慢性腎衰皮下脂肪GRP78蛋白的表達(dá)
　　 CRF組GRP78蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。
　　 (3)慢性腎衰皮下脂肪eIF2α、PERK、IRE1α的活化情況
　　 CRF組的p-eIF2α、p-PERK、p-IRE1α的活性與假手術(shù)組相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。e

36、IF2α、PERK、IRE1α總蛋白無(wú)變化。
　　 2、PBA抑制慢性腎衰皮下脂肪內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化
　　 (1) PBA抑制慢性腎衰皮下脂肪GRP78mRNA的表達(dá)
　　 CRF+PBA組GRP78mRNA的表達(dá)與CRF+Vehicle組相比顯著減弱(p＜0.05)。
　　 (2) PBA抑制慢性腎衰皮下脂肪GRP78蛋白的表達(dá)
　　 CRF+PBA組GRP78蛋白的表達(dá)與CRF+Vehicle組

37、相比顯著減弱(p＜0.05)。
　　 (3) PBA抑制慢性腎衰皮下脂肪eIF2α、PERK、IRE1α的活化
　　 CRF+PBA組的p-eIF2α、p-PERK、p-IRE1α的活性與CRF+Vehicle組相比顯著減弱(p＜0.05)。eIF2α、PERK、IRE1α總蛋白無(wú)變化。
　　 3、慢性腎衰內(nèi)臟脂肪內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表達(dá)情況
　　 (1)慢性腎衰內(nèi)臟脂肪GRP78mRNA的表達(dá)
　　 C

38、RF組GRP78mRNA的表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。
　　 (2)慢性腎衰內(nèi)臟脂肪GRP78蛋白的表達(dá)
　　 CRF組GRP78蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。
　　 (3)慢性腎衰內(nèi)臟脂肪eIF2α、PERK、IRE1α的活化情況
　　 CRF組的p-eIF2α、p-PERK、p-IRE1α的活性與假手術(shù)組相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。eIF2α、PERK、IRE1α

39、總蛋白無(wú)變化。
　　 4、PBA抑制慢性腎衰內(nèi)臟脂肪內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化
　　 (1) PBA抑制慢性腎衰內(nèi)臟脂肪GRP78mRNA的表達(dá)
　　 CRF+PBA組GRP78mRNA的表達(dá)與CRF+Vehicle組相比顯著減弱(p＜0.05)。
　　 (2) PBA抑制慢性腎衰內(nèi)臟脂肪GRP78蛋白的表達(dá)
　　 CRF+PBA組GRP78蛋白的表達(dá)與CRF+Vehicle組相比顯著減弱(p＜0.05)。

40、
　　 (3) PBA抑制慢性腎衰內(nèi)臟脂肪eIF2α、PERK、IRE1α的活化
　　 CRF+PBA組的p-eIF2α、p-PERK、p-IRE1α的活性與CRF+Vehicle組相比顯著減弱(p＜0.05)。eIF2α、PERK、IRE1α總蛋白無(wú)變化。
　　 三、PBA抑制慢性腎衰血中脂質(zhì)分解指標(biāo)的升高
　　 5/6腎切除后的第16周，采血，測(cè)定血中甘油三酯和甘油的水平，發(fā)現(xiàn)CRF組血甘油三酯和甘油

41、水平與假手術(shù)組相比顯著升高(p＜0.01)，而CRF+PBA組血甘油三酯和甘油水平與CRF+Vehicle組相比有所下降(p＜0.01)。
　　 四、PBA抑制慢性腎衰皮下和內(nèi)臟脂肪脂質(zhì)分解的升高
　　 1、慢性腎衰皮下和內(nèi)臟脂肪甘油含量增加
　　 (1) CRF組皮下脂肪甘油釋放量與假手術(shù)組相比顯著升高(p＜0.05)。
　　 (2) CRF組內(nèi)臟脂肪甘油釋放量與假手術(shù)組相比顯著升高(p＜0.05)。<

42、br>　　 2、PBA抑制慢性腎衰皮下和內(nèi)臟脂肪甘油含量的增加
　　 (1) CRF+PBA組皮下脂肪甘油釋放量與CRF+Vehicle組相比有所下降(p＜0.05)。
　　 (2) CRF+PBA組內(nèi)臟脂肪甘油釋放量與CRF+Vehicle組相比有所下降(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、慢性腎衰皮下和內(nèi)臟脂肪存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　 2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可部分抑制慢性腎衰脂肪組織的脂質(zhì)分