補腎活血方對Hpth(1-34)干預(yù)下成骨細胞的影響及其治療腎性骨病患者的遠期療效觀察.pdf

1、腎性骨病(ROD)是由慢性腎臟疾病及終末期腎臟疾病引起的體內(nèi)礦物質(zhì)和骨代謝系統(tǒng)紊亂的一組臨床癥候癥，它是慢性腎功能衰竭(CRF)常見、嚴重、治療困難的并發(fā)癥。當腎小球濾過率GFR<10ml/min時，幾乎100％的CRF患者都會發(fā)生ROD。
　　高轉(zhuǎn)運腎性骨病是三種腎性骨病中最常見的骨病類型。高轉(zhuǎn)換型腎性骨病的主要原因是繼發(fā)性甲旁亢，甲狀旁腺激素(PTH)分泌亢進，過量的PTH使骨重建過程的吸收和生成兩種功能均亢進，成骨、破骨細胞

2、異常增生活躍，而當破骨細胞增生大于成骨細胞，最終骨吸收大于骨形成，形成骨病。而成骨細胞與破骨細胞之間信息交流的分子基礎(chǔ)是成骨細胞表達的骨保護素(OPG)及其配體(RANKL)和破骨細胞表達的NF-kB的活化受體(RANK)，即OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)，PTH對其有調(diào)控作用。
　　目前西醫(yī)對ROD主要采取對癥治療，包括飲食治療、磷結(jié)合劑、活性維生素D類似物的應(yīng)用、合理調(diào)整血鈣、磷、iPTH水平、鈣敏感受體激動劑的應(yīng)用及透析方

3、式的調(diào)整，雖能部分改善腎性骨病患者的臨床癥狀，但臨床遠期療效并不理想，可能導(dǎo)致軟組織異位鈣化，引發(fā)心腦血管并發(fā)癥發(fā)生率增加，且存在藥物價格昂貴等多個問題。中醫(yī)從“腎主骨”理論出發(fā)，根據(jù)腎性骨病脾腎衰憊為本、濁瘀內(nèi)阻為標的基本病機，以補腎活血為大法，自擬補腎活血方(主要組成：熟地、川斷、狗脊、補骨脂、丹參、大黃、當歸)治療腎性骨病。以期通過調(diào)節(jié)骨代謝平衡，改善甲旁亢作用，發(fā)揮其治療作用。
　　1、研究目的：
　　本課題研究分為

4、實驗研究和臨床研究兩部分。
　　實驗研究目的在于通過體外模擬腎性骨病繼發(fā)性甲旁亢狀態(tài)，以人類重組甲狀旁腺激素(hPTH)干預(yù)的小鼠成骨細胞為研究對象，觀察補。腎活血含藥血清對其增殖、分化的影響及其對OPG及RANKL基因表達的影響，以探討補腎活血中藥治療腎性骨病的分子水平機制。
　　臨床研究則以隨訪形式追蹤觀察曾經(jīng)入組的服用補腎活血顆粒腎性骨病患者，從心血管并發(fā)癥、終點事件、骨代謝水平、生存質(zhì)量及營養(yǎng)狀況方面評定補腎活血方的

5、遠期臨床療效，更為臨床采用中醫(yī)藥治療腎性骨病提供相對客觀評價依據(jù)。
　　2、研究方法：
　　2.1實驗方法
　?、倥囵B(yǎng)成骨細胞MC3T3-E1，配制終濃度為10ng/ml的hPTH(1-34)溶液作為體外模擬甲旁亢的干預(yù)條件，制備中藥、西藥及正常鼠含藥血清，實驗分組。
　?、谟肕TT法在細胞培養(yǎng)的24h、48h、72h分別檢測不同濃度補腎活血方組對hPTH(1-34)干預(yù)下MC3T3-E1增殖的作用。
　　

6、③用ELISA方法在細胞培養(yǎng)的24h、48h、72h分別檢測不同濃度補腎活血含藥血清組細胞在hPTH(1-34)干預(yù)下其上清液中PICP和ALP分泌水平。
　?、懿捎脤崟r熒光定量PCR法在8h、12h、24h時，對PTH干預(yù)下的的小鼠成骨細胞的OPGmRNA、RANKLmRNA的表達進行絕對定量分析。
　　2.2臨床研究方法
　　本研究以2008年10月～2009年3月期間曾經(jīng)參與“補腎活血法改善腎性骨病病人生存質(zhì)量及

7、骨代謝異常臨床研究”課題的維持性血液透析腎性骨病患者為研究對象，治療組及對照組則根據(jù)當時是否接受中藥干預(yù)治療劃分，其中對照組采取規(guī)律活血顆粒。采用病例對照研究的血透、常規(guī)補鈣降磷等基本治療，而治療組則是在基本治療基礎(chǔ)上加以口服補腎方法，追蹤觀察兩組患者3年。臨床觀察指標主要包含兩部分，一為回顧性記錄3年中骨化三醇沖擊治療次數(shù)、心腦血管發(fā)生率、一年及三年生存率、終點事件發(fā)生率；另一為評估在3年觀察終位時間點時生存質(zhì)量評分、營養(yǎng)狀況評分，甲

8、狀旁腺激素水平、鈣、磷等骨代謝指標、腎功能指標、鈣、磷及鈣磷乘積達標率，將兩組觀察指標進行比較。所得數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)分布的計量資料采用t檢驗，非正態(tài)分布計量資料采用秩和檢驗，描述性計數(shù)資料采用卡方檢驗。
　　3、結(jié)果：
　　3.1實驗研究部分
　　3.1.1各組細胞增殖水平的比較：隨時間增加，中藥各濃度組細胞增殖水平明顯上升，而模型PTH組則從48h增殖率開始下降，當達到72h時，模型P

9、TH組OD值明顯低于正常組(P<0.05)，而各濃度中藥組細胞增殖水平均顯著高于模型PTH組(P<0.01)，且增殖水平呈劑量依賴性，即濃度越高增殖水平也越高。
　　3.1.2各組ALP、PICP分泌量的比較：①自48h始至72h，各濃度中藥含藥血清組ALP分泌量均顯著高于模型PTH組(P<0.01)；②而中藥高濃度組在72h時PICP分泌量顯著高于模型PTH組(P<0.01)。
　　3.1.3各組OPGmRNA及RANKL

10、mRNA表達水平的比較：①在經(jīng)一定濃度(10ng/ml)的PTH持續(xù)刺激后，成骨細胞OPGmRNA表達先是出現(xiàn)略微增高趨勢，之后開始出現(xiàn)表達抑制，至24h時OPGmRNA表達明顯抑制，表達量與正常組相比顯著減少，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；另一方面，隨時間延長RANKL表達量則呈不斷上升趨勢，且各個時間點均較正常組RANKL水平明顯升高，有顯著性差異(P<0.01)，表明PTH能明顯上調(diào)RANKLmRNA的表達；②補腎活血各濃度組及西

11、藥骨化三醇組隨時間延長，OPGmRNA水平逐漸升高，促進其表達，至24h時達到高峰；且各個時間點均較模型PTH組OPGmRNA水平增高，中藥組呈劑量依賴性，即補腎活血含藥血清濃度越高，OPGmRNA表達量也越高；③補腎活血各濃度組及西藥骨化三醇組RANKL表達量隨時間延長呈遞增趨勢，但從12h起，各組RANKL表達量均較模型組減低，且差異有顯著性(P<0.01)，至24h時，各組RANKL表達量仍較模型組低，且P<0.05，有顯著性差異

12、。中藥各濃度組中，高濃度組RANKL表達量最低，中濃度組次之，低濃度組最高。西藥骨化三醇在各個時間點RANKL表達量則與補腎活血中濃度組近似。
　　3.2臨床研究部分
　　3.2.1骨化三醇沖擊治療率：治療組骨化三醇沖擊治療率明顯低于對照組(P<0.05)，但治療組運用骨化三醇沖擊治療的頻次與對照組總體無顯著性差異。
　　3.2.2心血管并發(fā)癥發(fā)生率：兩組的心梗、腦梗、心絞痛及心律失常發(fā)生率雖無顯著性差異(P>0.05

13、)，但治療組急性心衰發(fā)生率明顯低于對照組(P<0.01)，且心絞痛發(fā)生頻次也明顯低于對照組，有顯著性差異(P<0.05)。
　　3.2.3終點事件：兩組骨折發(fā)生率均較低，兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)；兩組間一年生存率相比無顯著性差異，而三年生存率則有顯著性差異，治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)；兩組患者的死亡原因主要為心腦血管疾病和感染。
　　3.2.4骨代謝指標：治療組iPTH、血磷水平均顯著低于對照組(P<0.

14、05)，血鈣水平兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)；治療組鈣磷乘積達標率明顯高于對照組(P<0.05)，結(jié)果有顯著性差異。
　　3.2.5腎功能指標：兩組血肌酐及尿素氮水平相比，P均>0.05，無顯著性差異。
　　3.2.6生存質(zhì)量：①八個維度比較：治療組在生理機能(PF)和總體健康(GH)得分高于對照組，并有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，表明治療組在生理機能(PF)和總體健康(GH)方面優(yōu)于對照組；而生理職能(RP)、軀

15、體疼痛(BP)得分與對照組相比則無顯著性差異；治療組一般精力(VT)和精神健康(MH)方面得分均高于對照組(P<0.01)，有極顯著性差異，表明治療組患者一般精力及精神健康方面均明顯優(yōu)于對照組；而治療組在社會功能(SF)及情感職能(RE)方面，評分也均高于對照組(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)差異，治療組患者社會功能和情感職能也較對照組好。②在生理健康(PCS)總得分方面，治療組評分高于對照組，P<0.01，有極顯著性差異，說明治療組生理健康

16、優(yōu)于對照組；而治療組心理健康總得分(MCS)高于對照組，P<0.01，有極顯著性差異，治療組心理健康也優(yōu)于對照組。③治療組SF-36總分高于對照組，P<0.05，有顯著性差異。
　　3.2.7營養(yǎng)狀況：治療組存在營養(yǎng)風(fēng)險人數(shù)12人(25.5％)，而對照組則有20人(47.6％)，兩組相比，治療組存在營養(yǎng)風(fēng)險人數(shù)比低于對照組，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。說明治療組患者營養(yǎng)狀況較對照組好。
　　4、結(jié)論：
　　4.1補腎活

17、血方含藥血清能改善甲旁亢作用下成骨細胞的骨代謝作用，在促進hPTH(1-34)干預(yù)下小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖的同時，也能很好地促進其進一步分化成熟，進而促進成骨細胞骨形成，且促進效應(yīng)呈濃度依賴性。
　　4.2補腎活血方含藥血清能上調(diào)PTH干預(yù)下OPGmRNA的表達，降低PTH干預(yù)下RANKLmRNA的高表達，提示補腎活血方可能通過很好地促進骨形成，抑制甲旁亢引起的過度骨吸收作用機制來改善骨代謝平衡。并且中藥濃度越高，促進骨

18、形成作用越明顯，反之，中藥濃度越高抑制骨吸收作用也最強。補腎活血方組在體外調(diào)整骨代謝作用與西藥骨化三醇相近。
　　4.3補腎活血方能減少骨化三醇沖擊治療率，降低iPTH、高血磷水平，提高鈣磷乘積達標率，并能改善ROD患者生存質(zhì)量及營養(yǎng)狀況，減少心血管并發(fā)癥發(fā)生率，提高生存率，提示補腎活血方治療腎性骨病患者遠期療效好。
　　5、創(chuàng)新點：
　　5.1關(guān)于腎性骨病實驗研究模型的造模方法多采用大鼠部分腎切除加高磷飲食，本課題實

19、驗研究則從微觀入手，采用直接給予小鼠成骨細胞一定濃度PTH持續(xù)刺激的方法進行造模，在體外模擬甲旁亢狀態(tài)，此造模方法國內(nèi)外文獻未見報道；
　　5.2觀察補腎活血方能改善PTH干預(yù)下的OPG及RANKLmRNA的表達，從細胞分子生物學(xué)水平上評價補腎活血方促進骨形成，抑制過度骨吸收，改善骨代謝的作用；
　　5.3采用了目前最前沿的實驗方法Realtime-PCR法檢測小鼠成骨細胞中OPGmRNA及RANKLmRNA表達量，較以往普