PCV2分離株增殖特性研究及板藍(lán)根多糖、黃芪多糖對PCV2體外復(fù)制的影響.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)體外繁殖能力差,病毒感染細(xì)胞后增殖滴度低,且不產(chǎn)生細(xì)胞病變,病毒感染動物臨床表現(xiàn)不一,組織中病毒載量差異大。為了建立定量檢測PCV2及增殖滴度的方法,本研究采用SYBR Green I隨機(jī)結(jié)合法,利用常規(guī)PCR擴(kuò)增出PCV2 ORF2保守區(qū)域276bp片段,將其克隆到pMD—18載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒p-18T-276,并用作標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板優(yōu)化反應(yīng)條件,建立一種PCV

2、2 SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)品模板在5.60×101～2.74×109copies/μL時(shí)與Ct值呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為-1.00,斜率為-3.345。所建立的方法與豬圓環(huán)病毒1型、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖障礙與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒、豬細(xì)小病毒和豬瘟病毒均無交叉反應(yīng)。
　　 應(yīng)用建立的PCV2 SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法對PCV2感染細(xì)胞后的復(fù)制情況進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示

3、,在感染細(xì)胞96h時(shí),PCV2復(fù)制達(dá)到最高點(diǎn)。此外,利用建立的方法對本室保存的11個(gè)分離株在PK15細(xì)胞上繁殖特性進(jìn)行了研究,篩選到了4株高滴度毒株(河南株5、太平株、瑞豐株、宜陽株),豐富了圓環(huán)病毒疫苗株的研究資源。選擇8株毒株,以大致相等的拷貝數(shù)分別攻毒6周齡SPF昆明鼠,14天時(shí)剖殺并定量檢測PCV2在不同器官中的組織載量,發(fā)現(xiàn)河南株5和瑞豐株、太平株在靶組織中具有更高的增殖滴度。
　　 為了測定板藍(lán)根多糖、黃芪多糖體外抗

4、PCV2的效果,本試驗(yàn)按不同的加藥方式設(shè)計(jì)了2組試驗(yàn),第1組先接種病毒后加藥物,以觀察藥物能否對細(xì)胞內(nèi)的病毒起作用,抑制其生物合成及成熟釋放；第2組先加藥物后接種病毒,以觀察藥物能否阻斷病毒的吸附和進(jìn)入。結(jié)果表明,板藍(lán)根多糖對PCV2具有抑制和阻斷作用,其最小抑制濃度和最小阻斷濃度分別為9.375μg/mL和2.344μg/mL；黃芪多糖對PCV2亦有抑制作用和阻斷作用,其最小抑制濃度和最小阻斷濃度分別為18.750μg/mL和2.34