三種血小板生成關(guān)鍵因子共轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 通過構(gòu)建TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個(gè)真核表達(dá)載體，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，觀察三個(gè)真核表達(dá)載體在人骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 方法：
　　 1、分別對(duì)TPO、IL-6、IL-11三個(gè)基因片段克隆，再用PCR技術(shù)將克隆出來的TPO、IL-6、IL-11基因片段和pEGFP-N1、pcDNA3.1(+)、pcDNA

2、3.1(-)這三個(gè)質(zhì)粒分別連接，構(gòu)建成TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個(gè)真核表達(dá)載體，并進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序分析。
　　 2、用貼壁篩選法對(duì)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離，選用分裂能力強(qiáng)的第三代細(xì)胞做為轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個(gè)真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并采用細(xì)胞免

3、疫組化及Western blot法等方法檢測(cè)多基因轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細(xì)胞后在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、酶切及測(cè)序結(jié)果證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建TPO-pEGFP-N1、IL-6-pcDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個(gè)真核表達(dá)載體。
　　 2、人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)形態(tài)呈異質(zhì)性，原代細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，傳代后則均勻生長(zhǎng)。
　　 3、TPO-pEGFP-N1、IL-6-p

4、cDNA3.1(+)、IL-11-pcDNA3.1(-)三個(gè)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人骨髓基質(zhì)細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到TPO-pEGFP-N1的表達(dá)，25%細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)出IL-6及IL-11在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；經(jīng)Western blot檢測(cè)：TPO蛋白表達(dá)(TPO/GAPDH IOD比值)在正常對(duì)照組為(0.17±0.01)，空載體轉(zhuǎn)染組為(0.18±0.01)，多基因轉(zhuǎn)染組為(0.62±0.01)；IL-6蛋白表達(dá)(I

5、L-6/GAPDH IOD比值)在正常對(duì)照組為(0.14±0.01)，空載體轉(zhuǎn)染組為(0.18±0.04)，多基因轉(zhuǎn)染組為(0.34±0.06)；IL-11蛋白表達(dá)(IL-11/GAPDH IOD比值)在正常對(duì)照組為的(0.8±0.23)，空載體轉(zhuǎn)染組為(0.19±0.14)，多基因轉(zhuǎn)染組為(1.62±0.23)。多基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功。
　　 結(jié)論：
　　 1、通過分子