沙門氏菌血清分型分子靶點的發(fā)掘及鑒定體系的建立.pdf

1、沙門氏菌是最常見的食源性致病菌之一，它引起的食物中毒病例在世界范圍內常常排在首位。該菌有2500多個血清型，近50個血清組。但是，能夠感染人類的致病菌株主要集中于4個血清組（即血清組A、B、C和D）中，其中傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和雞沙門氏菌等8種血清型是最常見的感染人體和禽畜類動物的菌型。傳統(tǒng)的血清學分型方法存在著許多缺陷，不能及時、準確地鑒定菌株

2、的血清型。PCR方法以快速、靈敏、準確等優(yōu)點逐漸成為其重要的替代方法之一。
　　本研究通過生物信息學技術建立了靶點發(fā)掘平臺，采用比較基因組的方法，分別發(fā)掘了沙門氏菌血清組A-D和上述8種常見血清型沙門氏菌的特異PCR檢測靶點，并以此分別建立了血清組和血清型多重PCR檢測體系，可鑒定A-D血清組及8種血清型的菌株。
　　沙門氏菌血清組A-D多重PCR檢測體系的建立。分別從NCBI，Sanger研究院，美國伊利諾斯州大學和美國華

3、盛頓大學基因組測序中心等基因組數據庫下載到沙門氏菌已經測序菌株的全基因組序列，并按照沙門氏菌的血清組形式建立6個血清組的基因組庫:A型，B型，C1型，C2型，D型和其他型。除其他型外，每個庫中選擇一株代表菌株，將其基因組序列依次切割成長度為986 bp的DNA片段，然后將這些片段與所有的沙門氏菌的基因組進行序列比對，選擇出僅在代表菌株所屬基因組庫中存在的DNA片段，所得片段將作為PCR檢測的候選靶點。血清組A、B、C1、C2和D分別發(fā)掘

4、到2、6、7、10和7個特異序列。以這些特異序列為模板，分別設計引物，通過PCR方法分別選出每個血清組中特異性和靈敏度俱佳的引物對。將這5個血清組的引物對進行組合建立多重PCR體系。應用該體系對107株來自不同血清組的沙門氏菌分離株的進行檢測，結果表明，本研究建立的PCR體系驗證結果與Luk等建立的B、C2和D(A)血清組多重PCR體系以及血清學鑒定結果一致。檢測食品樣品時，只需增菌12h，就可從初始接菌量在≤5 cfu/10mL的牛乳

5、樣品中檢測出陽性結果。
　　沙門氏菌8種常見血清型多重PCR檢測體系的建立。按照類似的方式建立8個沙門氏菌血清型的基因組庫:傷寒沙門氏菌/丙型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、雞沙門氏菌以及其他血清型庫。將每個血清型庫中的代表菌株的基因型序列也切割成986 bp的DNA片段，與所有的沙門氏菌的基因組進行序列比對，選出每個血清型的候選靶點，分別有1、11、18、1、22、

6、4和3個。經PCR篩選出各個血清型中特異性和靈敏度皆優(yōu)的引物對，構建多重PCR體系。該體系可從153株分離株鑒定出腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等8種血清型，與血清學驗證的結果一致;只需增菌12h，便可從初始接菌量在≤5 cfu/10mL的牛乳樣品中檢測出這8種血清型。
　　沙門氏菌血清組與血清型靶點基因的功能分析。沙門氏菌血清組的32個特異靶點中，含有34個基因，主要是rfb基因、膜蛋白基因和纖毛基因。這些基因主要與糖的合成與代謝

7、、糖基的轉移或者運輸有關，對沙門氏菌血清組的0抗原的形成和保持穩(wěn)定起著至關重要的作用，說明血清組間的差異與菌株的LPS的糖基有著密切關系。經基因功能分析，沙門氏菌的血清型特異靶點對應的基因主要是噬菌體基因、致病因子基因、轉座子基因、限制性內切酶基因等。這些基因與移動元件和毒力基因密切相關，可使菌株對其宿主和環(huán)境產生適應性，可能是這些菌株為了更好的適應不同的宿主和環(huán)境而產生了相應的血清型。
　　沙門氏菌分離株的PCR分子檢測與MLS

8、T分型。437株來自食品、養(yǎng)殖場和臨床的沙門氏菌分離株，分別用建立的血清組和血清型鑒定體系進行分子血清分型。這些分離株被鑒定出A、B、C1、C2和D五個血清組，以及傷寒與副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、雞沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和阿貢納沙門氏菌等血清型，與血清學鑒定結果相比，兩者的Kappa值都處于0.80以上，說明結果基本一致。其中，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌占了40～50％，這兩種血清型的菌株用MLST

9、方法進行了亞分型分析，腸炎沙門氏菌的ST型較為單一，以ST11為主，是世界范圍內極為普遍的菌型;鼠傷寒沙門氏菌的ST型有5種分型，其中臨床和養(yǎng)殖場的分離株以ST19型為主，食品菌株則以ST34為主，還發(fā)現了3種只出現在東亞和東南亞范圍的ST新型。根據菌株的耐藥檢測結果發(fā)現，鼠傷寒沙門氏菌的ST型與其耐藥性有一定的相關性，其中ST34型菌株的耐藥種類最多，通?？梢詫?～8種抗生素產生抗性。經進化分析，發(fā)現食品分離株與臨床分離株具有十分緊密