沙門氏菌血清分型分子靶點(diǎn)的發(fā)掘及鑒定體系的建立.pdf

1、沙門氏菌是最常見(jiàn)的食源性致病菌之一，它引起的食物中毒病例在世界范圍內(nèi)常常排在首位。該菌有2500多個(gè)血清型，近50個(gè)血清組。但是，能夠感染人類的致病菌株主要集中于4個(gè)血清組（即血清組A、B、C和D）中，其中傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和雞沙門氏菌等8種血清型是最常見(jiàn)的感染人體和禽畜類動(dòng)物的菌型。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法存在著許多缺陷，不能及時(shí)、準(zhǔn)確地鑒定菌株

2、的血清型。PCR方法以快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為其重要的替代方法之一。
　　本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)建立了靶點(diǎn)發(fā)掘平臺(tái)，采用比較基因組的方法，分別發(fā)掘了沙門氏菌血清組A-D和上述8種常見(jiàn)血清型沙門氏菌的特異PCR檢測(cè)靶點(diǎn)，并以此分別建立了血清組和血清型多重PCR檢測(cè)體系，可鑒定A-D血清組及8種血清型的菌株。
　　沙門氏菌血清組A-D多重PCR檢測(cè)體系的建立。分別從NCBI，Sanger研究院，美國(guó)伊利諾斯州大學(xué)和美國(guó)華

3、盛頓大學(xué)基因組測(cè)序中心等基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載到沙門氏菌已經(jīng)測(cè)序菌株的全基因組序列，并按照沙門氏菌的血清組形式建立6個(gè)血清組的基因組庫(kù):A型，B型，C1型，C2型，D型和其他型。除其他型外，每個(gè)庫(kù)中選擇一株代表菌株，將其基因組序列依次切割成長(zhǎng)度為986 bp的DNA片段，然后將這些片段與所有的沙門氏菌的基因組進(jìn)行序列比對(duì)，選擇出僅在代表菌株所屬基因組庫(kù)中存在的DNA片段，所得片段將作為PCR檢測(cè)的候選靶點(diǎn)。血清組A、B、C1、C2和D分別發(fā)掘

4、到2、6、7、10和7個(gè)特異序列。以這些特異序列為模板，分別設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR方法分別選出每個(gè)血清組中特異性和靈敏度俱佳的引物對(duì)。將這5個(gè)血清組的引物對(duì)進(jìn)行組合建立多重PCR體系。應(yīng)用該體系對(duì)107株來(lái)自不同血清組的沙門氏菌分離株的進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，本研究建立的PCR體系驗(yàn)證結(jié)果與Luk等建立的B、C2和D(A)血清組多重PCR體系以及血清學(xué)鑒定結(jié)果一致。檢測(cè)食品樣品時(shí)，只需增菌12h，就可從初始接菌量在≤5 cfu/10mL的牛乳

5、樣品中檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。
　　沙門氏菌8種常見(jiàn)血清型多重PCR檢測(cè)體系的建立。按照類似的方式建立8個(gè)沙門氏菌血清型的基因組庫(kù):傷寒沙門氏菌/丙型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、雞沙門氏菌以及其他血清型庫(kù)。將每個(gè)血清型庫(kù)中的代表菌株的基因型序列也切割成986 bp的DNA片段，與所有的沙門氏菌的基因組進(jìn)行序列比對(duì)，選出每個(gè)血清型的候選靶點(diǎn)，分別有1、11、18、1、22、

6、4和3個(gè)。經(jīng)PCR篩選出各個(gè)血清型中特異性和靈敏度皆優(yōu)的引物對(duì)，構(gòu)建多重PCR體系。該體系可從153株分離株鑒定出腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等8種血清型，與血清學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果一致;只需增菌12h，便可從初始接菌量在≤5 cfu/10mL的牛乳樣品中檢測(cè)出這8種血清型。
　　沙門氏菌血清組與血清型靶點(diǎn)基因的功能分析。沙門氏菌血清組的32個(gè)特異靶點(diǎn)中，含有34個(gè)基因，主要是rfb基因、膜蛋白基因和纖毛基因。這些基因主要與糖的合成與代謝

7、、糖基的轉(zhuǎn)移或者運(yùn)輸有關(guān)，對(duì)沙門氏菌血清組的0抗原的形成和保持穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，說(shuō)明血清組間的差異與菌株的LPS的糖基有著密切關(guān)系。經(jīng)基因功能分析，沙門氏菌的血清型特異靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因主要是噬菌體基因、致病因子基因、轉(zhuǎn)座子基因、限制性內(nèi)切酶基因等。這些基因與移動(dòng)元件和毒力基因密切相關(guān)，可使菌株對(duì)其宿主和環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性，可能是這些菌株為了更好的適應(yīng)不同的宿主和環(huán)境而產(chǎn)生了相應(yīng)的血清型。
　　沙門氏菌分離株的PCR分子檢測(cè)與MLS

8、T分型。437株來(lái)自食品、養(yǎng)殖場(chǎng)和臨床的沙門氏菌分離株，分別用建立的血清組和血清型鑒定體系進(jìn)行分子血清分型。這些分離株被鑒定出A、B、C1、C2和D五個(gè)血清組，以及傷寒與副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、雞沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和阿貢納沙門氏菌等血清型，與血清學(xué)鑒定結(jié)果相比，兩者的Kappa值都處于0.80以上，說(shuō)明結(jié)果基本一致。其中，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌占了40～50％，這兩種血清型的菌株用MLST

9、方法進(jìn)行了亞分型分析，腸炎沙門氏菌的ST型較為單一，以ST11為主，是世界范圍內(nèi)極為普遍的菌型;鼠傷寒沙門氏菌的ST型有5種分型，其中臨床和養(yǎng)殖場(chǎng)的分離株以ST19型為主，食品菌株則以ST34為主，還發(fā)現(xiàn)了3種只出現(xiàn)在東亞和東南亞范圍的ST新型。根據(jù)菌株的耐藥檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌的ST型與其耐藥性有一定的相關(guān)性，其中ST34型菌株的耐藥種類最多，通常可以對(duì)6～8種抗生素產(chǎn)生抗性。經(jīng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)食品分離株與臨床分離株具有十分緊密