不同血流動力學狀態(tài)對肝臟熱缺血再灌注損傷的影響及干預研究.pdf

1、研究背景：
　　肝移植是治療許多終末期器質(zhì)性肝病唯一而有效的治療方法，但供體的缺乏使移植手術(shù)的適用范圍受到很大的限制。我國每年有30多萬病人死于各種終末期肝病，每年急需肝移植挽救生命的患者眾多，而近年來，我國每年肝移植手術(shù)僅有2000例左右。美國器官移植的等待者和器官捐獻者的比例為5∶1，英國為3∶1，而中國高達150∶1。
　　由于缺乏自愿捐獻，中國此前絕大多數(shù)的移植器官來源于死囚捐獻。我國以死囚尸體為來源的供肝在國際上受

2、到爭議，并且有日趨減少的趨勢。而活體供體因涉及對供體有一定的損傷，故較難廣泛開展。衛(wèi)生部副部長黃潔夫近期表示，我國將盡快建立器官捐獻體系，公民逝世后器官捐獻應該成為中國器官移植的主要來源，在3-5年內(nèi)改變主要依靠死囚來獲得移植器官的方式。
　　尸體供肝除來源于死囚供體外，還來源于公民逝世后的器官捐獻，包括心臟死亡供體(donors of cardiac death，DCD)和腦死亡供體（donors of brain death，

3、DBD）。雖然腦死亡供體的肝臟質(zhì)量較高，但我國目前腦死亡尚未立法，難以廣泛開展腦死亡供體的肝移植。而心臟死亡供體的肝臟活力雖然可能有不同程度的下降，但現(xiàn)階段我國的醫(yī)學界和法律界仍以心臟死亡作為判斷死亡的主要標準，故來源于心臟死亡供體的供肝，雖只占目前我國供肝的較小部分，但卻是未來發(fā)展的重點和趨勢之一。公民心臟死亡后器官捐獻將逐步成為中國器官移植的主要來源。
　　1995年國際無心跳供體研討會制定了馬斯特里赫特(Maastricht

4、)分類標準，該標準將供體分為5類:Ⅰ類:入院時已死亡者，屬于“不可控制”型。Ⅱ類:心肺復蘇失敗者，屬于“不可控制”型。Ⅲ類:等待心臟停跳的瀕死者，未達到腦干死亡標準的即將死亡病人，治療無望的病人，預測撤除支持治療后短時間內(nèi)很快會發(fā)生心臟停跳，可見于神經(jīng)外科重癥監(jiān)護病房、一般重癥監(jiān)護病房、冠心病重癥監(jiān)護病房、創(chuàng)傷急診病房和一般病房的病人，屬于“可控制”型。Ⅳ類:病人在腦死亡的基礎上發(fā)生心跳驟停，屬于“可控制”型。Ⅴ類:危重病人發(fā)生意外的心

5、臟驟停，屬于“不可控制”型。衛(wèi)生部目前正在力推心臟死亡后器官捐贈，已經(jīng)頒布了《中國心臟死亡器官捐獻指南》，倡導進行第Ⅲ類供體的院內(nèi)器官捐獻。
　　心臟死亡供體的特點是供肝的熱缺血損傷較明顯，從撤除心肺支持設備到心跳停止、宣布死亡、切取肝臟，供體肝臟經(jīng)歷的熱缺血時間較長，且常常經(jīng)歷多種不同的血流動力學狀態(tài)，如低血壓、缺血、淤血等。臨床上迫切需要回答以下問題:如何評估此類供肝的熱缺血損傷？如何減少供肝的熱缺血損傷？心臟死亡供體的原發(fā)病

6、不同，造成的血流動力學改變不同，為此，有必要研究不同的血流動力學狀態(tài)單獨對肝臟熱缺血再灌注損傷的影響，了解其內(nèi)在機制及干預因素。本研究即針對以上情況，借助大鼠肝臟熱缺血模型展開。
　　肝臟缺血的本質(zhì)之一是缺氧，本實驗選取了在組織缺氧損傷調(diào)控中扮演重要角色的缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）進行研究，檢測不同的血流動力學狀態(tài)下肝組織的HIF-1表達是否存在差異。通過使用干預HIF-1

7、活性的藥物，進一步驗證HIF-1在不同血流動力學處理后肝臟熱缺血再灌注損傷中的作用。實驗分為以下三個部分。
　　第一部分不同血流動力學狀態(tài)對大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的影響
　　目的:對大鼠的部分肝臟進行熱缺血處理，且針對該部分肝臟的不同血管（肝動脈、門靜脈、肝靜脈）分別進行阻斷，來研究不同血流動力學狀態(tài)，對大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的影響。
　　方法:108只SD大鼠隨機分為3組:肝動脈阻斷組(hepatic arter

8、y clamping group，HAC)、門靜脈阻斷組(hepatic portal vein clamping group，HPC)和肝靜脈阻斷組(hepatic veinclamping group，HVC)，按50％肝臟血流阻斷模型分別阻斷以上血管，按阻斷持續(xù)時間再分為15分鐘、30分鐘和60分鐘（共分為9小組，每小組n=12）。主要研究指標:①缺血不同時間后，進行再灌注2小時、6小時、12小時、24小時和48小時，檢測再灌注后

9、不同時間血清ALT變化（每小組n=6）;②缺血不同時間后，進行再灌注6小時，檢測血管阻斷不同部位及時間對以下指標的影響:血清ALT、TB，肝組織MPO和MDA含量（每小組n=6）;③缺血30分鐘后，進行再灌注6小時，檢測不同血管阻斷對以下指標的影響:肝組織病理學檢查，活體熒光顯微鏡觀察大鼠肝臟微循環(huán)狀態(tài)，Real-time PCR方法檢測肝組織TNF-α，IL-1，IL-6 mRNA，TUNEL法原位標記肝細胞凋亡，ELISA檢測Cas

10、pase-3活性，Western blot方法檢測肝組織中凋亡相關(guān)蛋白（3小組，每小組n=6）;④所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS13.0進行統(tǒng)計學處理，均數(shù)的比較采用t檢驗及單因素方差分析。
　　結(jié)果:本實驗通過分別阻斷大鼠部分肝臟的肝動脈、門靜脈分支和肝靜脈屬支，建立了不同類型的肝臟血流阻斷模型，模擬了心臟死亡供體肝臟常見的三種熱缺血血流動力學狀態(tài):肝動脈低氧，肝組織缺血和肝靜脈淤血。①三組大鼠肝臟經(jīng)歷不同時間熱缺血后，

11、血清ALT一般于再灌注后6小時達到峰值，此后逐漸下降;HVC組ALT顯著高于HAC組和HPC組(P＜0.01);②血管阻斷不同部位及時間對大鼠血清ALT、TB，肝組織MDA和MPO含量有明顯影響:HVC組熱缺血再灌注損傷程度較其他組明顯加重，血流阻斷60分鐘組各項指標明顯差于15分鐘及30分鐘組(P＜0.05);③不同血管阻斷對以下指標有影響:肝細胞壞死、肝竇無灌注比例、肝組織TNF-α，IL-1，IL-6 mRNA、肝細胞凋亡水平、C

12、aspase-3活性、凋亡相關(guān)蛋白表達等均存在較顯著差異，HVC組熱缺血再灌注損傷程度較其他組明顯加重（P＜0.05）。
　　結(jié)論:不同的肝臟血流動力學缺血狀態(tài)及其持續(xù)時間，對其后繼再灌注損傷及其恢復有明顯不同的影響。熱缺血時間越長，肝臟再灌注損傷越嚴重，這種損傷在再灌注較早期就迅速表現(xiàn)出來。大鼠肝臟熱缺血在不超過30分鐘時，損傷相對較小而可逆，而超過60分鐘后，損傷嚴重而較難逆轉(zhuǎn)。肝臟熱缺血時間最好控制30分鐘以內(nèi)。三組大鼠肝臟

13、熱缺血再灌注損傷存在較顯著差異，肝靜脈阻斷組損傷程度較其他組明顯加重。
　　第二部分不同血流動力學狀態(tài)對大鼠肝臟HIF-1差異表達的影響
　　目的:觀察大鼠肝臟不同血管阻斷、熱缺血后，肝組織局部微循環(huán)、氧供、能量代謝的情況，并重點研究肝組織HIF-1α蛋白和HIF-1α mRNA表達、分布的特點，研究各組之間HIF-1α的差異。進一步研究經(jīng)歷不同血流動力學肝臟缺血再灌注后，各組大鼠肝功能和肝組織形態(tài)學改變的特點。
　　

14、方法:216只SD大鼠隨機分為3組:HAC組、HPC組、HVC組，按50％肝臟血流阻斷模型分別阻斷以上血管，按阻斷時間再分為15分鐘、30分鐘和60分鐘（共分為9小組，每小組n=24，另設假手術(shù)組作為對照，不阻斷血流）。主要研究指標:①缺血不同時間后即刻，取大鼠肝臟標本，進行HE染色病理學檢查;缺血后即刻，活體熒光顯微鏡觀察肝組織微循環(huán)情況;缺血后即刻，通過乏氧染色，檢測肝組織氧合狀態(tài)的變化及其分布特點，通過微透析法，檢測肝組織葡萄糖、

15、甘油糖原、乳酸和丙酮酸代謝水平（每小組n=6）;②肝臟缺血再灌注2小時后，Western blot和Real-time PCR的方法分別檢測肝組織HIF-1α蛋白和mRNA的表達水平，免疫組化方法對HIF-1α表達進行組織定位，分析大鼠肝臟HIF-1α表達與缺氧、血管阻斷不同部位及時間的關(guān)系（每小組n=6）;③缺血再灌注6小時后和24小時后，測定大鼠肝功能、肝組織MPO活性的變化，觀察肝組織形態(tài)學的改變（每小組n=12）;④所得數(shù)據(jù)以均

16、數(shù)±標準差表示，均數(shù)的比較采用t檢驗及單因素方差分析。
　　結(jié)果:①缺血后即刻，隨著血流阻斷時間的延長，肝組織的損傷加劇，HAC組損傷較輕，而HVC組損傷較重，尤其是在經(jīng)過60分鐘的血流阻斷后，出現(xiàn)較明顯肝竇充血、肝細胞氣球樣變性和壞死;肝竇功能密度、肝竇內(nèi)紅細胞流速、肝組織血流等微循環(huán)指標、肝組織氧合和葡萄糖、甘油糖原、乳酸/丙酮酸(lactate/pyruvate，L/P)比值等代謝指標，HAC組優(yōu)于HPC組，HPC組優(yōu)于HV

17、C組（P＜0.05）;三組中肝組織乏氧染色陽性分布特點不同，HAC組和HVC組陽性染色集中于肝小葉中央靜脈周圍，HPC組集中于匯管區(qū)周圍;②在HAC組或HPC組，細胞核中HIF-1α蛋白量增加明顯(P＜0.05），在HVC組，肝組織中檢測到較少的HIF-1α蛋白，但其HIF-1αmRNA的表達出現(xiàn)了較明顯的增加;在各實驗組中，HIF-1α蛋白染色的陽性區(qū)域與乏氧染色的陽性區(qū)域一致，表明缺氧是HIF-1α蛋白在細胞核內(nèi)聚集的觸發(fā)因素;③再

18、灌注后HVC組的損傷最重，在血流阻斷60分鐘、再灌注24小時后，HVC組肝組織出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學改變，肝細胞的壞死嚴重而廣泛，呈現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的改變:肝小葉結(jié)構(gòu)塌陷，肝竇充血，肝細胞變性;肝組織Suzuki評分HVC組最高（HAC、HPC、HVC組分別為0.83±0.04，2.21±0.59，3.89±0.08，各組間差異具有顯著統(tǒng)計學意義，P＜0.01）;再灌注24小時后，各組ALT回落，TB輕度升高，MPO降低。
　　結(jié)論:肝臟的

19、熱缺血損傷與肝組織缺氧有關(guān)。肝臟缺氧導致了肝組織的微循環(huán)障礙和能量代謝改變。肝臟缺氧誘導了在血流阻斷后再灌注早期，HIF-1α蛋白在細胞核內(nèi)的聚集，但由于肝腺泡的血流分布特點，HIF-1α蛋白在不同血流動力學情況下，在各血流阻斷組的表達量及分布部位存在差異。HIF-1α蛋白對肝組織熱缺血再灌注損傷有保護作用，但對不同的血流動力學熱缺血狀態(tài)其肝臟保護程度不同。
　　第三部分 HIF-1干預對大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的影響
　　

20、目的:通過2-甲氧基雌二醇(2-ME)抑制HIF-1α表達，觀察肝組織缺血再灌注損傷是否加重，2-ME干預對不同的血流動力學缺血狀態(tài)肝臟的影響是否不同，進一步驗證HIF-1蛋白對肝臟熱缺血再灌注損傷的保護作用和調(diào)控機制。
　　方法:324只SD大鼠隨機分為3組:HAC組、HPC組、HVC組，按50％肝臟血流阻斷模型分別阻斷以上血管，按阻斷時間再分為15分鐘、30分鐘和60分鐘，以上各小組大鼠再分為2-ME干預組和未干預組，干預組血

21、流阻斷前腹腔內(nèi)注射2-ME，未干預組注射生理鹽水（每小組n=18）。主要研究指標:①檢測各組大鼠肝臟缺血30分鐘再灌注6小時和24小時后血清ALT、TB(n=12);②缺血30分鐘再灌注24小時后肝組織病理學檢查(n=6);③缺血15、30和60分鐘再灌注2小時后肝組織HIF-1α蛋白表達(n=6);④缺血15、30和60分鐘再灌注6小時后肝組織MPO和MDA含量(n=6);⑤缺血30分鐘再灌注24小時后Real-time PCR方法檢

22、測肝臟HO-1、eNOS、iNOS和A2AR mRNA表達(n=6)。⑥所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，均數(shù)的比較采用t檢驗及單因素方差分析。
　　結(jié)果:①2-ME干預減緩了各組大鼠缺血30分鐘再灌注6小時后ALT下降的趨勢，而加重了TB上升的趨勢:干預后HAC組ALT由(218±10) U/L升高至(560±17) U/L，TB由(8.38±1.03) umol/L升高至(15.0±1.88) umol/L，HPC組ALT由(459

23、±7) U/L升高至(847±27) U/L，TB由(17.3±2.22) umol/L升高至(23.1±1.37) umol/L, P＜0.05;②2-ME干預加重了肝組織的熱缺血再灌注損傷的病理形態(tài)學改變;③在HAC組和HPC組，在2-ME干預后，發(fā)現(xiàn)了HIF-1α蛋白量的表達減少，P＜0.05。在HVC組，在2-ME干預后，HIF-1α蛋白量的表達有輕度增加;④2-ME干預后HAC組、HPC組MDA和MPO的含量升高了;⑤2-ME

24、干預后，各組大鼠肝組織HO-1、A2AR和iNOS mRNA的表達水平與未干預前比較，存在差異，尤其在HPC組和HVC組較明顯，P＜0.05;在各組中，eNOS mRNA的表達水平在2-ME干預前后變化不明顯。
　　結(jié)論:使用HIF-1α的抑制劑2-ME，加重了肝臟的熱缺血再灌注損傷，表現(xiàn)為肝功能變差，肝小葉結(jié)構(gòu)完整性變差，肝臟中MDA和MPO含量升高。2-ME干預后，肝組織HIF-1α蛋白表達減少;2-ME干預對HAC、HPC組