ω-3脂肪酸后處理保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷的血流動(dòng)力學(xué)及形態(tài)學(xué)研究.pdf

1、研究背景:缺血再灌注損傷是一個(gè)涉及多種機(jī)制的復(fù)雜病理生理過程,隨著社會(huì)人口老齡化和心臟外科的不斷發(fā)展,冠脈的介入治療和體外循環(huán)手術(shù)得到了廣泛開展,術(shù)后可能出現(xiàn)的缺血再灌注損傷也逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)問題,越來越受到心臟外科醫(yī)生和體外循環(huán)灌注師的重視。心肌缺血再灌注損傷是指在短時(shí)間心肌血供中斷,一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供后原缺血心肌發(fā)生較血供恢復(fù)前更嚴(yán)重的損傷。研究表明氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、中性粒細(xì)胞聚集

2、和細(xì)胞凋亡等因素均可能參與發(fā)病過程。
　　 但長期以來,對于心肌保護(hù)的研究主要集中于低溫、停搏液等外源性保護(hù)機(jī)制的研究,使得心肌保護(hù)的應(yīng)用相對局限。1986年Murry等發(fā)現(xiàn)狗心臟多次短暫的缺血可以減輕隨后較長時(shí)間的缺血再灌注帶來的心肌損傷,由此提出心肌缺血預(yù)處理的概念。后來大量的實(shí)驗(yàn)研究也印證了心肌缺血預(yù)處理可以起到明確的心肌保護(hù)作用。但由于這種預(yù)處理需要在發(fā)生缺血前進(jìn)行,使其臨床應(yīng)用價(jià)值大大受限。對于很多心功能不全及終末期心

3、臟病人,其心臟功能往往已經(jīng)很差,而手術(shù)治療不可避免的會(huì)產(chǎn)生心肌缺血再灌注損傷,導(dǎo)致其心臟功能進(jìn)一步惡化,所以心肌保護(hù)的意義顯得尤為重要,但面對這樣的情況大部分傳統(tǒng)的心肌保護(hù)措施因?yàn)槭チ藨?yīng)用的時(shí)機(jī)而顯得作用有限。針對已缺血心肌,如何設(shè)法減輕再灌注損傷,成為心肌保護(hù)研究的一個(gè)難點(diǎn)。2003年Zhao等發(fā)現(xiàn)心肌缺血后在再灌注前進(jìn)行短暫的心肌缺血再灌注能保護(hù)心肌,對抗隨后的心肌缺血再灌注損傷,提出了缺血后處理這一內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的概念,為缺血再

4、灌注損傷的防治提供了一個(gè)新的思路及方向。目前研究表明對已缺血的心肌于再灌注開始時(shí)給予適量藥物,可產(chǎn)生類似于后處理的心肌保護(hù)作用,即藥物模擬后處理。藥物模擬后處理的可操作性明顯強(qiáng)于常規(guī)意義上的缺血后處理,具有更為實(shí)際的臨床應(yīng)用前景。
　　 自腺苷模擬后處理成功應(yīng)用于心臟瓣膜置換手術(shù)中,證實(shí)其心肌保護(hù)作用確切,藥物后處理的研究成為心肌保護(hù)的重點(diǎn)。但目前文獻(xiàn)報(bào)道用于模擬后處理的藥物并不多,主要有腺苷、阿片類物質(zhì)、揮發(fā)性麻醉藥物等,且由

5、于藥物本身的副作用或藥物本身的特點(diǎn),使其臨床應(yīng)用受到了一定的限制。那么尋找更加安全有效、便于臨床應(yīng)用的缺血后處理藥物,無疑具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值。近年來,ω-3脂肪酸在心肌保護(hù)方面的作用越來越引起研究者的關(guān)注。ω-3脂肪酸屬于多不飽和脂肪酸,主要包括α-亞麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等。
　　 作為營養(yǎng)制劑,不飽和脂肪酸已在臨床安全應(yīng)用多年,近年來的研究表明ω-3脂肪酸有抗炎、調(diào)節(jié)免疫及臟器保護(hù)的作用。

6、Vande等人通過建立狗在體缺血再灌注損傷模型發(fā)現(xiàn)在復(fù)灌期間給予脂肪乳劑后狗心臟收縮功能明顯改善；McGuinness等在新西蘭白兔心肌缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn),ω-3脂肪酸預(yù)處理可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞熱休克蛋白的大量表達(dá),降低了心肌梗死面積。ω-3脂肪酸還可通過作用于心肌細(xì)胞的離子通道、離子泵、交換體等影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定、氧化應(yīng)激發(fā)揮其心肌保護(hù)的作用。有研究報(bào)道ω-3脂肪酸可以減少心肌耗氧量,減少心肌缺血再灌注時(shí)氧化應(yīng)激及K+的丟失,從而減少再灌

7、注性心律失常。大規(guī)模的臨床試驗(yàn)也證明每日攝入500mg/d或1g/d的含有EPA和DHA的多不飽和脂肪酸可顯著的減少心血管事件的發(fā)生幾率。因此,ω-3脂肪酸的心肌保護(hù)作用愈來愈引起人們的重視。
　　 目前ω-3脂肪酸的研究大部分都集中在其預(yù)處理對心肌的保護(hù)作用。由于藥物模擬后處理的機(jī)制尚不完全清楚,且缺乏大組的隨機(jī)、雙盲、對照、多中心的臨床觀察結(jié)果,因而目前尚無一種安全、高效的模擬后處理的藥物應(yīng)用于臨床。本實(shí)驗(yàn)旨在利用大鼠離體心

8、肌缺血再灌注損傷模型觀察ω-3脂肪酸后處理對大鼠心功能指標(biāo)、心肌梗死面積以及心肌細(xì)胞線粒體損傷程度的影響,研究ω-3脂肪酸的心肌保護(hù)作用。
　　 目的:本研究采用大鼠心臟離體灌流模型,研究ω-3脂肪酸后處理是否能改善心臟缺血再灌注期間的機(jī)械做功,是否能有效減少心肌梗死面積,并用電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)及損傷程度,從而探討ω-3脂肪酸后處理是否具有心肌保護(hù)作用及其保護(hù)機(jī)制。為尋找一種可安全有效地應(yīng)用于臨床心肌缺血再灌注防治

9、的藥物提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 1.60只SPF級雄性SD大鼠,體重為200～300g,隨機(jī)分為持續(xù)灌注組(Con組),缺血再灌注組(I/R組),缺血后處理組(Post組)及ω-3脂肪酸后處理組(Post-ω組),每組15只。
　　 2.大鼠經(jīng)腹腔注射肝素1000U/kg抗凝,半小時(shí)后經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉,麻醉后迅速固定在動(dòng)物手術(shù)臺上,打開胸腔,在主動(dòng)脈距其起始部4～5mm處

10、迅速將主動(dòng)脈和其他血管一并剪斷,立即置于盛有4℃冷K—H液的培養(yǎng)皿中,洗凈殘血,簡單修剪后主動(dòng)脈插管固定于Langendorff灌注裝置上,以含有95％的O2+5％的CO2的混合氣飽和K-H液灌注心臟。維持灌注液高度在100cm左右,灌流液溫度保持在37.0℃,灌注液pH保持在7.4。K-H液成分:NaCl118mmol/L,KCl3.2mmol/L,KH2PO41.2mmol/L,NaHCO325mmol/L,CaCl22.5mmol

11、/L,葡萄糖5.5mmol/L,MgSO41.6mmol/L,pH值7.4。Con組持續(xù)灌注150min,其余各組均平衡灌注30 min,全心缺血30 min,再灌注90 min,Post組在再灌注開始前進(jìn)行4個(gè)循環(huán)的復(fù)灌20s/缺血20s,Post-ω組在再灌注開始前用ω-3脂肪酸持續(xù)灌注15min。
　　 3.于左心耳處剪開一小口,將帶有小乳膠水囊的測壓管經(jīng)左房及二尖瓣口插入左心室,連接多通道生理記錄儀持續(xù)監(jiān)測血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

12、,向小水囊里注入37℃的生理鹽水,使左心室舒張壓為4～5mmHg,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都保持此前負(fù)荷不變,記錄平衡灌注末及再灌注30min、60min、90min時(shí)左室舒張末壓(LVEDP)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室最大收縮壓(LVSF)、左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dtmax)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將心肌由心尖部向心底部切成1mm厚的薄片,TTC染色后存活心肌呈磚紅色,梗死區(qū)不著色呈灰白色,置于玻片上,

13、拍照后以Image J1.37軟件計(jì)算心肌梗死面積百分比。并取心尖部組織戊二醛固定后制成標(biāo)本通過透射電子顯微鏡11500倍放大下進(jìn)行隨機(jī)拍照觀察線粒體形態(tài)。
　　 結(jié)果
　　 1.大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)變化:各組平衡灌注末心功能指標(biāo)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與Con組相比,后三組大鼠心功能均存在不同程度的損害,與I/R組相比,Post-ω組可明顯增加復(fù)灌30min、60min及90min左室內(nèi)壓上升最大速率(+d

14、p/dtmax,P<0.01)和左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dtmax,P<0.05)。與I/R組相比,Post組也可增加+dp/dtmax和-dp/dtmax,但結(jié)果無顯著差異性(P>0.05)。
　　 2.大鼠心肌梗死面積的影響:經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析后得出各組心肌梗死面積百分比為:Con組(11.14±3.09),I/R組(34.15±3.06),Post組(26.94±2.73),Post-ω組(23.28±2.60)。與

15、I/R組比較,Post組及Post-ω組可顯著減少大鼠心肌梗死面積(P<0.01),Post組與Post-ω組組間比較無明顯差異性(P>0.05)。
　　 3.大鼠心肌線粒體透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化:Con組大鼠心肌線粒體體積基本正常,包膜完整,嵴排列整體、連續(xù),基質(zhì)密度正常；I/R組心肌細(xì)胞線粒體大量腫脹變形,嵴數(shù)量明顯減少,斷裂、溶解,線粒體基質(zhì)電子密度降低,線粒體體積變?。籔ost組線粒體結(jié)構(gòu)和I/R組相比病變有所改善,但