靶向乏氧微環(huán)境喜樹堿類衍生物HCNO-YCS-O3對肺癌A549細胞抑制作用研究.pdf

1、第一部分:HCNO-YCS-03體外抑瘤活性和乏氧選擇性研究
　　 目的:
　　 HCNO-YCS-03是一種喜樹堿(camptothecin，CPT)類衍生物，該衍生物在喜樹堿類藥物拓撲替康(topotecin，TPT)1號位點加載乏氧觸發(fā)器氮氧結構。在乏氧環(huán)境下，HCNO-YCS-03可有效還原激活，發(fā)揮殺滅腫瘤作用。本研究應用體外細胞培養(yǎng)技術及流式細胞術，研究HCNO-YCS-03體外抑瘤活性及乏氧選擇性。

2、　　 方法:
　　 應用TPT作為陽性對照藥物，MTT法測定HCNO-YCS-03對人源性肺癌A549細胞、胰腺癌Panc-1細胞、肝癌HepG2細胞和胃癌SGC-7901細胞在常氧和乏氧兩種環(huán)境下抑制作用，比較體外抑制作用強度及乏氧選擇性。選擇合適的瘤株，應用流式細胞術檢測肺癌A549細胞在不同培養(yǎng)時間和不同藥物濃度下凋亡情況。
　　 結果:
　　 1.MTT法篩選:HCNO-YCS-03在常氧環(huán)境下對A54

3、9，Panc-1，SGC-7901和HepG2細胞IC50值分別為16.1±1.6μg/ml，11.5±0.9μg/ml，21.5±3.8μg/ml，15.8±2.2μg/ml;HCNO-YCS-03在乏氧環(huán)境下對這4株腫瘤株的IC50值分別為3.3±0.5μg/ml，4.1±0.7μg/ml，16.7±3.4μg/ml，9.0±1.4μg/ml;TPT在常氧環(huán)境下對這4株腫瘤株的IC50值分別為2.9±0.3μg/ml，2.2±1.0

4、μg/ml，26.5±5.9μg/ml，8.4±1.7μg/ml;TPT在乏氧環(huán)境下對這4株腫瘤株的IC50值分別為2.0±0.6μg/ml，1.9±0.3μg/ml，17.5±4.7μg/ml，6.8±0.9μg/ml。上述數(shù)據(jù)說明HCNO-YCS-03在體外對多種腫瘤細胞有細胞毒性作用，尤其對A549細胞，HCNO-YCS-03具有明顯乏氧選擇性，其常氧、乏氧環(huán)境下IC50值有統(tǒng)計學差異p＜0.05，細胞毒作用與陽性藥物TPT相當。

5、
　　 2.流式細胞術檢測:乏氧環(huán)境下，1μg/ml、4μg/ml和16μg/mlHCNO-YCS-03作用于A549細胞24h細胞凋亡率分別為(31.3±3.7)％、(49.3±4.2)％和(65.7±5.7)％，4μg/mlHCNO-YCS-03作用12、24和48h的凋亡率分別為(22.9±3.4)％、(49.3±4.2)％和(58.6±4.9)％，與空白對照組(12.4±1.7)％的細胞凋亡率相比，隨著藥物濃度和給藥時間

6、延長，細胞凋亡率顯著增加p＜0.05。而在常氧環(huán)境下，1μg/ml、4μg/ml和16μg/mlHCNO-YCS-03作用24h的凋亡率分別為(17.4±2.5)％、(21.9±2.1)％和(28.6±3.2)％，4μg/mlHCNO-YCS-03作用12、24和48h的凋亡率分別為(13.4±2.8％)、(21.9±2.1)％和(26.3±3.0)％，與空白對照組(10.2±1.3)％的凋亡率相比，隨著藥物濃度和給藥時間延長，細胞凋亡

7、率也顯著增加p＜0.05，但增加幅度不如乏氧環(huán)境下顯著。說明HCNO-YCS-03對肺癌A549細胞具有很好乏氧選擇性，并且對A549細胞凋亡的誘導呈劑量和時間依賴性。
　　 結論:
　　 1、HCNO-YCS-03在體外對肺癌A549細胞、胰腺癌Panc-1細胞、胃癌SGC-7901細胞和肝癌HepG2細胞均有一定細胞毒性，尤其對肺癌A549細胞的毒性作用最強，其IC50值與陽性藥物TPT相當;
　　 2、HC

8、NO-YCS-03具有很好的乏氧選擇性;
　　 3、HCNO-YCS-03對肺癌A549細胞的抑制作用呈時間和劑量依賴性;
　　 第二部分:HCNO-YCS-03體內(nèi)抑瘤活性、HIF-1α活性影響及毒副作用研究
　　 目的:
　　 研究HCNO-YCS-03體內(nèi)抗肺癌A549細胞活性、A549細胞缺氧誘導因子1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）表達的影響及藥物的毒副作用

9、。
　　 方法:
　　 收集對數(shù)生長期A549細胞，用生理鹽水重懸并調整細胞濃度至5×107/ml。取4-6周齡裸鼠，每只右側腋窩皮下注射0.2ml細胞懸液，建立A549移植瘤模型。建模第12天移植瘤體積100±20mm3時，隨機分為四組:空白對照組（生理鹽水）、低劑量組(HCNO-YCS-035mg/kg)、高劑量組(HCNO-YCS-0310mg/kg)和陽性對照組(TPT2mg/kg)，分別予以生理鹽水、HCNO-

10、YCS-035mg/kg、HCNO-YCS-0310mg/kg和TPT2mg/kg腹腔給藥進行干預，評估HCNO-YCS-03對腫瘤生長抑制作用。切取腫瘤組織行組織切片檢查，TUNEL法檢測HCNO-YCS-03對腫瘤組織細胞凋亡誘導作用。免疫組化法檢測HCNO-YCS-03對HIF-1α的影響。同時對干預結束荷瘤鼠行血液學檢查，以檢測HCNO-YCS-03毒副作用。
　　 結果:
　　 1.荷瘤鼠腫瘤抑制作用觀測HCN

11、O-YCS-03兩劑量組荷瘤鼠體重與空白對照組無明顯差別，而陽性對照組荷瘤鼠體重明顯低于其他三組p＜0.05。高劑量組荷瘤鼠中位生存期明顯大于空白對照組和陽性對照組p＜0.05，而陽性對照組中位生存期與空白對照組幾乎相同。這些說明，HCNO-YCS-03的毒副作用明顯低于TPT。
　　 空白對照組與其他三組之間比較，其他三組腫瘤體積明顯下降p＜0.05，其中高劑量組腫瘤體積大于陽性對照組，但無統(tǒng)計學差異。低劑量組、高劑量組和陽性

12、對照組腫瘤抑制率分別為31.4％、49.7％和57.7％，高劑量組腫瘤抑制率較陽性對照低，但無顯著差異。說明HCNO-YCS-03在體內(nèi)有顯著抗腫瘤活性，但較TPT稍弱。
　　 2.TUNEL法檢測細胞凋亡低劑量組、高劑量組、陽性對照組與空白對照組組比較，腫瘤細胞凋亡率明顯上升p＜0.05;高劑量組腫瘤細胞凋亡率明顯低于陽性對照組p＜0.05。說明HCNO-YCS-03在體內(nèi)有顯著的抗腫瘤活性，但較TPT弱。
　　 3.

13、免疫組化法檢測HIF-1α低劑量組、高劑量組、陽性對照組與生理鹽水組比較，HIF-1α表達明顯受到抑制p＜0.05;高劑量組對HIF-1α的抑制能力較陽性對照組差，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義。結果說明HCNO-YCS-03可顯著抑制腫瘤組織HIF-1α的表達。
　　 4.血液學檢查評估藥物毒副作用低劑量組、高劑量組與空白對照組比較，荷瘤鼠的白細胞(Whitebloodcell,WBC)、紅細胞(Redbloodcell，RBC)、

14、血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)、血小板(platelet,PLT)以及肝腎功能相關指標（谷丙轉氨酶（Alanineaminotransferase,ALT）、堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AKP)、肌酐(Creatinine，CREA)、尿素氮(Urea,UREA))均無明顯差異。陽性對照組荷瘤鼠的WBC和PLT明顯低于其他三組p＜0.05，而肝功能相關指標(ALT、AKP)則明顯高于其他三組p＜0.05。