兩種萜類化合物對肺癌A549細(xì)胞增殖抑制作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、前言：肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位。目前對肺癌的治療包括:手術(shù)、放療、化療等治療方法,但現(xiàn)有的治療方法副作用多,療效不令人滿意。肺癌的死亡率仍很高,5年生存率低于15％。所以,人們希望找到療效好且不良反應(yīng)低的治療肺癌及其他惡性腫瘤的方法。近年來,從中藥中提取的抗癌藥物因其抗腫瘤作用確切,副作用小而成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究選取的藥物土貝母苷甲(Tubeimoside

2、-1)和長梗秦艽酮(Waltonitone)均為從中藥中提取的三萜類化合物。土貝母為葫蘆科植物土貝母的干燥塊莖,具有抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。土貝母苷甲是從土貝母中分離獲得的有效成分之一,為五環(huán)三萜化合物。長梗秦艽為龍膽科龍膽屬植物,主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肝膽疾病等。長梗秦艽酮是從長梗秦艽中分離得到的一個五環(huán)三萜化合物。國內(nèi)外已有研究證實(shí)土貝母苷甲及長梗秦艽酮可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 本實(shí)驗(yàn)研

3、究土貝母苷甲、長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用及其分子機(jī)制,為深入研究土貝母苷甲、長梗秦艽酮抗腫瘤機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為應(yīng)用于臨床治療肺癌提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 一、土貝母苷甲、長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響的研究采用四甲基偶氮噻藍(lán)(MTT)法檢測土貝母苷甲、長梗秦艽酮對A549細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的影響;采用流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

4、;熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化;采用western blotting方法檢測土貝母苷甲、長梗秦艽酮對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)的影響。
　　 二、長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響的研究采用Transwell小室分析長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞遷移的影響;Transwell小室分析長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞侵襲的影響;Western blotting檢測MMP-2、MMP-9侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　

5、　 三、MicroRNA在長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞增殖抑制中的作用的研究利用AFFX miRNA表達(dá)譜芯片檢測長梗秦艽酮作用前后A549細(xì)胞中miRNA表達(dá)差異,篩選出長梗秦艽酮抑制A549細(xì)胞作用的靶miRNA。
　　 結(jié)果：
　　 一、土貝母苷甲、長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響MTT法檢測結(jié)果顯示隨著濃度的加大和作用時間的延長,土貝母苷甲及長梗秦艽酮對A549細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,呈現(xiàn)明顯的

6、時間-劑量效應(yīng)關(guān)系;長梗秦艽酮對HUVEC細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用。流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡率表明隨著土貝母苷甲、長梗秦艽酮濃度的增高,早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加,與對照組相比差異具有顯著性。熒光電子顯微鏡觀察土貝母苷甲、長梗秦艽酮作用后的細(xì)胞中可見染色體邊集、核碎裂等典型的凋亡改變,而對照組沒有相應(yīng)的變化。經(jīng)過不同濃度土貝母苷甲、長梗秦艽酮處理A549細(xì)胞24小時后,western blotting方法檢測結(jié)果顯示,隨著土貝母

7、苷甲、長梗秦艽酮濃度的不斷增加,Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高,而Bcl-2蛋白表達(dá)水平隨濃度的增加逐漸降低,Bax/Bcl-2的比值逐漸升高。
　　 二、長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響的研究應(yīng)用Transwell小室檢測長梗秦艽酮對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響,發(fā)現(xiàn)長梗秦艽酮處理后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移、侵襲能力有明顯降低,遷移及侵襲過Transwell小室膜的細(xì)胞隨藥物濃度的增加逐漸減少,并具有劑量依賴性。采用w

8、estern blotting方法檢測MMP-2、MMP-9侵襲相關(guān)蛋白表達(dá),隨藥物濃度的增加,MMP-2、MMP-9表達(dá)減少,并具有劑量依賴性。
　　 三、MicroRNA在長梗秦艽酮對A549細(xì)胞增殖抑制中的作用AFFX miRNA表達(dá)譜芯片檢測長梗秦艽酮作用前后A549細(xì)胞中miRNA表達(dá)差異,篩選出長梗秦艽酮抑制A549細(xì)胞的靶miRNA,其中27個miRNA表達(dá)顯著差異(1.5倍以上改變)。
　　 結(jié)論：

9、>　　 1、土貝母苷甲、長梗秦艽酮可以抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖,這種抑制作用具有時間和濃度依賴性;其中長梗秦艽酮對HUVEC細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用,呈現(xiàn)高效低毒特點(diǎn)。土貝母苷甲、長梗秦艽酮抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖是通過誘導(dǎo)其凋亡來實(shí)現(xiàn)的。
　　 2、土貝母苷甲、長梗秦艽酮可能通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達(dá)誘發(fā)A549細(xì)胞凋亡。
　　 3、長梗秦艽酮能夠抑制A549細(xì)胞的遷移及侵襲能力。抑制移動、侵襲可能與抑制M