SREBP-DDAH-ADMA途徑在高胰島素血癥所致血管內(nèi)皮損傷中的作用.pdf

1、本文從以下三部分進(jìn)行了闡述。
　　第一章高胰島素血癥對(duì)冠心病患者血漿非對(duì)稱性二甲基精氨酸水平的影響。
　　目的:2型糖尿病(T2DM)疾病早期或使用胰島素治療期間均有高胰島素血癥，高胰島素血癥促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)，內(nèi)皮來(lái)源的NO減少是其損傷的特征性表現(xiàn)，非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)是內(nèi)源性NOS抑制劑，減少NO合成，為心血管死亡預(yù)測(cè)因子。本章研究擬探討高胰島素

2、血癥對(duì)人體血漿ADMA的影響，為高胰島素血癥損傷內(nèi)皮提供依據(jù)。
　　方法:來(lái)自2009年9月～2010年5月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院心內(nèi)科冠心病患者及體檢中心健康人群，共89人，分為三組:(1)正常對(duì)照組(Con):30例;(2)冠心病組(CAD):30例;(3)冠心病合并高胰島血癥組(CAD+Hins):29例。測(cè)身高、體重，計(jì)算體重指數(shù)(BMI);測(cè)腰圍、臀圍，計(jì)算腰/臀(WHR);測(cè)血壓。采集過(guò)夜空腹10 h靜脈血5mL，全自動(dòng)生化

3、分析儀測(cè)定:肝功能、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr); AXSYM全自動(dòng)標(biāo)記免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)空腹胰島素(Fins)、餐后2h胰島素(2h-PIns)。
　　結(jié)果:1.CAD+Hins組、CAD組、Con組三組間性別、年齡、血壓、肝功能無(wú)顯著性差異，存在可比性。2

4、.CAD+Hins組BMI，F(xiàn)PG，F(xiàn)ins，2h-Pins，HOMA-IR均顯著高于CAD組和Con組(P＜0.05)，CAD組上述指標(biāo)顯著高于Con組(P＜0.05)。3.各組間TC無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，CAD+Hins組和CAD組的TG、HDL-C以及UA、Cr、BUN均顯著高于Con組(P＜0.05); CAD組LDL-C顯著高于Con組(P＜0.05); CAD+Hins組UA顯著高于CAD組(P＜0.05)。4.CAD+Hins組A

5、DMA、hs-CRP水平顯著高于CAD組和Con組(P＜0.05); CAD組ADMA顯著高于Con組(P＜0.05)。5.未發(fā)現(xiàn)血漿ADMA與其他生化指標(biāo)的相關(guān)性。
　　結(jié)論:1.高胰島素血癥加重已患冠心病患者的糖、脂代謝與尿酸代謝障礙。2.高胰島素血癥引起冠心病患者血漿ADMA水平進(jìn)一步升高，是內(nèi)皮功能損傷加重的表現(xiàn);3.合并高胰島素血癥的冠心病患者血漿hs-CRP水平升高，提示高胰島素血癥與慢性炎癥有關(guān)。
　　第二章高

6、胰島素血癥大鼠血漿ADMA/NO和主動(dòng)脈SREBP、DDAH變化及與內(nèi)膜損傷關(guān)系。
　　目的:第一章臨床研究發(fā)現(xiàn)合并高胰島素血癥的冠心病患者血漿ADMA水平顯著高于單純冠心病患者與健康對(duì)照，提示高濃度胰島素對(duì)內(nèi)皮的損傷作用。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)是水解ADMA的關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)體內(nèi)ADMA濃度。DDAH啟動(dòng)子區(qū)含有能與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)相結(jié)合的膽固醇調(diào)節(jié)組件(SRE)，提示SREBPs可結(jié)合SRE調(diào)節(jié)D

7、DAH的表達(dá);研究表明:高胰島素有促進(jìn)SREBPs表達(dá)的作用。探討高胰島素血癥SD大鼠主動(dòng)脈SREBPs、DDAH的表達(dá)有助于進(jìn)一步闡述高胰島素?fù)p傷內(nèi)皮的具體機(jī)制。本章研究擬建立高胰島素血癥SD大鼠動(dòng)物模型，直接闡述高胰島素對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷作用并探討其可能機(jī)制。
　　方法:采用持續(xù)皮下注射胰島素方法建立高胰島素血癥SD大鼠模型(Hins)(N=7)，并設(shè)立對(duì)照組SD大鼠(Con)(N=7)。大鼠處死前測(cè)體重，尾靜脈采血測(cè)空腹血糖(

8、FBG);心臟穿刺法留取空腹血標(biāo)本，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP); ELISA法血漿空腹胰島素(Fins)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);比色法測(cè)血漿NO、高效液相色譜(HPLC)法測(cè)血漿ADMA濃度。大鼠處死后立刻開(kāi)胸，分離升主動(dòng)脈組織，快速存入液氮，4％甲醛固定。提取大鼠主動(dòng)脈組織蛋白，Western-

9、Blotting法檢測(cè)主動(dòng)脈SREBP-1、SREBP-2，DDAH-1、DDAH-2蛋白表達(dá);Trizol法提取主動(dòng)脈組織mRNA，RT-PCR法檢測(cè)上述基因表達(dá)。
　　結(jié)果:1.Hins組大鼠血漿空腹血糖、胰島素、HOMA-IR與甘油三酯(TG)均顯著高于Con組大鼠(P＜0.05)，高胰島素血癥SD大鼠模型成功。2.Hins組大鼠體重顯著性高于Con組大鼠(P＜0.05)。3.兩組大鼠膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LD

10、L-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Hins組大鼠ADMA、hs-CRP顯著高于Con組(P＜0.05)，NO顯著低于Con組(P＜0.05)。4.與Con組大鼠相比，Hins組大鼠主動(dòng)脈組織SREBP-1、SREBP-2蛋白與基因表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，DDAH-1、DDAH-2蛋白與基因表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。5.主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變:Con組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，細(xì)胞排列整齊，層次清晰;Hins組大鼠主動(dòng)

11、脈內(nèi)膜不規(guī)整，細(xì)胞排列紊亂。
　　結(jié)論:1.持續(xù)皮下注射胰島素可制作高胰島素血癥SD大鼠模型，為研究高胰島素對(duì)機(jī)體的影響提供了可行的動(dòng)物模型;2.高胰島素血癥SD大鼠血漿ADMA濃度升高、NO濃度降低，提示內(nèi)皮功能受損;3.高胰島素血癥SD大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜形態(tài)發(fā)生改變，為內(nèi)皮受損表現(xiàn);4.高胰島素血癥SD大鼠主動(dòng)脈組織SREBP-1、SREBP-2基因與蛋白表達(dá)增加，DDAH1、DDAH2基因與蛋白表達(dá)降低，可能是高胰島素?fù)p傷血管內(nèi)

12、皮新機(jī)制。
　　第三章高胰島素對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DDAH1、DDAH2基因和蛋白表達(dá)的影響及其機(jī)制研究。
　　目的:高胰島素血癥是心血管事件的重要危險(xiǎn)因素，我們前期臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):高胰島素抑制DDAH基因與蛋白表達(dá)，促進(jìn)SREBPs基因與蛋白表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本章通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)高胰島素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞DDAH1和DDAH2基因與蛋白表達(dá)的影響，并利用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，抑制SREBP-1和SREBP-2基因表達(dá)，以

13、探討高胰島索引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的具體機(jī)制。
　　方法:1、采用不同濃度的胰島素處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human UmbilicalVein Endothelial Cells，HUVEC)，并分為24小時(shí)和48小時(shí)處理組，測(cè)定葡萄糖攝取率，分析不同濃度胰島素、作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞攝取葡萄糖能力的影響。2、順利完成siRNA轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)后，將HUVEC分為兩大組，分別用于siRNA轉(zhuǎn)染 SREBP-1和SREBP-2實(shí)驗(yàn)，siRNA轉(zhuǎn)染S

14、REBP-1實(shí)驗(yàn)具體分組如下:(1)A1組:正常培養(yǎng)HUVEC48h;(2) B1組:培基中6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞48h;(3) C1組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-NC，6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)48h;(4)D1組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-SREBP1，正常培養(yǎng)48h;(5) E1組: HUVEC轉(zhuǎn)’染siRNA-SREBP1，6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)48h。siRNA轉(zhuǎn)染SREBP-2實(shí)驗(yàn)具體

15、分組如下:(6) A2組:正常培養(yǎng)HUVEC48h;(7) B2組:培基中6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞48h;(8) C2組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-NC，6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)48h;(9) D2組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-SREBP2，正常培養(yǎng)48h;(10)E2組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-SREBP2，6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)48h。細(xì)胞經(jīng)上述處理完畢后，提取各組mRNA和蛋白，Real-

16、Time PCR檢測(cè)SREBP-1、SREBP-2、DDAH1和DDAH2的基因表達(dá)，Western-Blot檢測(cè)上述蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1.低濃度胰島素促HUVEC攝取葡萄糖，隨著胰島素濃度的升高，HUVEC的葡萄糖攝取率逐漸增高，當(dāng)胰島素濃度超過(guò)一定范圍后，隨著胰島素濃度的升高，HUVEC的葡萄糖攝取率反而隨之下降。2.6×10-8mol/L胰島素孵育HUVEC48h顯著誘導(dǎo)HUVEC中的SREBP-1和SREBP-2的基因

17、和蛋白表達(dá)(P＜0.05)，同時(shí)顯著誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染si-RNA-NC組的SREBP-1和SREBP-2的基因和蛋白表達(dá)(P＜0.05)。3.6×10-8mol/L胰島素孵育HUVEC48h顯著抑制HUVEC的DDAH1、2基因與蛋白表達(dá)(P＜0.05)，同時(shí)顯著抑制轉(zhuǎn)染si-RNA-NC組的SREBP-1、2基因與蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。4.單純轉(zhuǎn)染siRNA-SREBP-1和siRNA-SREBP-2組不能上調(diào)DDAH1、2基因和蛋白表

18、達(dá)，但轉(zhuǎn)染了siRNA-SREBP-1、2的高胰島素處理組DDAH1、2基因與蛋白的下調(diào)作用被顯著削弱(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.高濃度胰島素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞攝取葡萄糖，可能與損傷有關(guān);2.高濃度胰島素促進(jìn)入臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SREBP-1和SREBP-2的基因和蛋白表達(dá)，抑制其DDAH1和DDAH2的基因和蛋白表達(dá);3.siRNA沉默人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SREBP-1和SREBP-2基因，削弱了高胰島素對(duì)DDAH1和DDAH2