人朊蛋白基因的克隆表達(dá)及抗血清的制備.pdf

1、以人外周血液提取的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增人朊蛋白編碼基因(PRNP)的ORF，克隆至pMD18T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒HoPRNP-T，用DNAstar軟件與GenBank上發(fā)表的序列M13899進(jìn)行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核苷酸序列同源性為99.6﹪，氨基酸序列同源性99.8﹪。以HoPRNP-T質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出編碼人成熟朊蛋白(matureprionprotein，mPrP)的基因片斷，與pET30a(+)表達(dá)載體連接，構(gòu)建出表達(dá)人m

2、PrP的重組質(zhì)粒pET-homPrP。經(jīng)酶切鑒定后電轉(zhuǎn)化pET-homPrP至宿主菌EcoliBL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物為分子量為約30ku的融合蛋白。超聲波裂解重組菌體后用Ni-NTA親和層析法純化融合蛋白，以SDS-PAGE檢測(cè)純化的表達(dá)產(chǎn)物，表明親和層析法純化的融合蛋白純度可達(dá)到90﹪。再以SAF70進(jìn)口單抗為檢測(cè)抗體，Western-blotting顯示融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。以純化

3、的融合mPrP作為免疫原，以含有pET30a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)的菌體蛋白作為對(duì)照免疫原，分別與弗氏完全佐劑1∶1混合乳化，按100μg/只劑量皮下分3點(diǎn)注射8周齡清潔級(jí)BALB/c雌性小鼠，在第3周和第5周以同法、同劑量弗氏不完全佐劑乳化的兩種免疫原分別進(jìn)行加強(qiáng)免疫，第3次免疫3天后摘眼球取血，用間接ELISA法檢測(cè)抗血清的效價(jià)。結(jié)果表明抗人mPrP的血清效價(jià)為1∶512；Western-blotting比較分