重組FHL2的原核表達、純化及抗血清的制備.pdf

1、目的和意義： FHL2作為新確定的癌基因，其功能及作用機制尚不完全清楚。本研究通過構(gòu)建FHL2原核表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中進行表達并分離得到純化的FHL2重組蛋白，進而制備FHL2抗血清，為FHL2的進一步研究及臨床試劑盒開發(fā)提供實驗材料。 材料和方法： 1.主要材料 大腸腺癌細胞株Lovo，原核表達質(zhì)粒pET22b+，弗氏完全/不完全佐劑，新西蘭大白兔。 2.方法 2.1引物設(shè)計

2、上游引物AACGAATTCCATGACTGAGCGCTTTGACTG包含了EcoRI的酶切位點，下游引物TTTGTCGACGATGTCTTTCCCACAGTCGG包含了SalI的酶切位點。用該對引物擴增的PCR產(chǎn)物預(yù)期目的片段長度為854bp。 2.2FHL2基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 LOVO大腸癌細胞(由本室常規(guī)培養(yǎng)保存)用含有100mL/LFCS的RMPI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。用Trizol(TaKaRa公司產(chǎn)品)

3、提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒(寶曼靈公司產(chǎn)品)說明操作。取2μlcDNA用上游引物和下游引物進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：50℃1h，94℃30s，55℃30s，72℃45s，6個循環(huán)，94℃30s，65℃30s，72℃45s，32個循環(huán)。所得目的片段用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、SalI雙酶切后插人pET22b+的EcoRI與SalI之間，所得質(zhì)粒命名為pET2b+/FHL2，進行測序。 2.3FHL2基因在大腸桿菌中的表達

4、 含有pET2b+/FHL2質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)plysS接種含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)8h，取0.5ml過夜菌接種于含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)液4.5mL中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)4h，加入500mmol/LIPTC至終濃度為1mmol/L，25℃劇烈震蕩培養(yǎng)4h，取1ml菌液進行SDS-PAGE鑒定。 2.4rhFHL2蛋白的分離與純化 取1000mL誘導(dǎo)表達的菌液，

5、10000轉(zhuǎn)/分4℃離心2min，菌體沉淀加入1/20細胞生長體積的細菌裂解液和PMSF，超聲破碎細菌。10000轉(zhuǎn)/分，4℃離心15min。棄上清，往沉淀加入1/20原細菌生長體積的UrNTA-0Buffer(20mMTris-HC1pH7.9，0.5MNaCl，10％Glycerol，8MUrea)和PMSF，懸浮細菌，室溫放置30min。10000轉(zhuǎn)/分，4℃離心15min，取上清。用50ml的UrNTA-0Buffer平衡5mL

6、NTA層析柱。上清液上柱，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。用25ml的UrNTA-0Buffer洗脫未結(jié)合成分，然后分別用25mlUrNTA-20，UrNTA-40，UrNTA-60，UrNTA-100，UrNTA-200，UrNTA-500(UrNTA-0Buffer含20-500mmol/LMidazole)洗脫，收集洗脫液，SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。PBS透析24h，每6h更換PB

7、S1次，BCA法測蛋白濃度，-70℃保存。 2.5兔抗重組融合蛋白rhFHL2抗血清的制備 取純化的融合蛋白rhFHL2800l(約800μg)與800l弗氏完全佐劑徹底乳化，經(jīng)背部皮下多點注射新西蘭白兔。首次免疫后4周取純化的融合蛋白FHL2400l(約400g)與400l弗氏不完全佐劑徹底乳化，進行第2次免疫，之后第6，8周分別用rhFHL2加強免疫1次，最后一次免疫不加佐劑。最后1次加強免疫后8d耳緣靜脈采血2mL

8、，測定血清中抗體的效價。并于最后1次免疫后10d，頸動脈插管放血，分離血清，置-80℃保存。 2.6ELISA法測定效價及抗體的純化 純化后的融合蛋白rhFHL2按5g/ml，50l/孔，包被酶標(biāo)板，分別加入等比稀釋的血清，洗后加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗孵育，最后加OPD底物液顯色，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測定OD492nm，以等于陰性對照孔平均值的2.1倍者判為陽性。 2.7兔抗融合蛋白rhFHL2抗體的純化

9、 往10ml免疫兔血清中加等量的PBS(pH7.4)；逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液，于4℃靜置30min；4℃4000轉(zhuǎn)/分離心15min；棄上清，沉淀用20ml預(yù)冷的PBS溶解，逐滴加入10mL飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30min；4℃4000轉(zhuǎn)/分離心15min，收集沉淀，沉淀用20ml預(yù)冷的PBS溶解，獲得純化的IgG抗體。PBS透析24h，每6h更換PBS1次，后加等體積的甘油，再加入疊氮鈉至終濃度0.02％，分裝后-70℃保

10、存。 2.8兔抗rhFHL2抗體的特性鑒定 Lovo細胞高表達FHL2，用制備的兔抗融合蛋白抗體對其作Westernblot分析。收集細胞，抽提蛋白，蛋白樣品變性后以40g每孔上樣，SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以封閉液(50mmol/LTris-Buffered-Saline，pH7.5，含1％BSA和0.1％Tween20)于37℃振蕩封閉2h，再加入以封閉液稀釋(1:500)的兔抗rhFH

11、L2抗血清，于4℃孵育過夜，洗膜后加1:2500稀釋的HRP-羊抗兔IgG于37℃溫育1h，充分洗滌后以DAB顯色。 SW480也同樣高表達FHL2，將SW480接種在蓋玻片上，用3.7％多聚甲醛固定，5％BSA封閉，滴加按1:200稀釋的FHL2抗血清，37℃孵育1h，經(jīng)PBST沖洗后，加入生物素化抗兔二抗，37℃孵育20min，再次PBST洗滌后，滴加SABC試劑，孵育20min，PBST洗滌，DAB顯色，蘇森素復(fù)染細胞核，

12、封片后鏡下觀察。 結(jié)果： 1、FHL2原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 通過RT-PCR獲得了854bp的FHL2基因片段，成功地構(gòu)建了FHL2的原核表達質(zhì)粒pET22b+/FHL2，經(jīng)測序與GenBank公布的一致。 2、融合蛋白的誘導(dǎo)表達 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，含重組質(zhì)粒的大腸桿菌能夠表達相對分子質(zhì)量M:37084的重組rhFHL2蛋白，并且rhFHL2主要存在于沉淀部分，即rhFHL2是以不可溶性的包涵體形式

13、存在。 3、抗體的制備純化 用純化的融合蛋白HIS-FHL2作抗原，免疫大白兔，所得的多克隆抗血清，用ELISA檢測?？寡宓男r為1:12500。 4、抗人FHL2多克隆抗體的評價 用制備的多克隆抗體對融合蛋白HIS-FHL2作Westernblot分析，在約40KD處呈現(xiàn)特異性的結(jié)合條帶，表明所制備的抗體特異性極佳，用WesternBlot分析時最低稀釋度為1:500，說明靈敏度極高。 免疫細

14、胞實驗和免疫組織實驗也證實了抗FHL2可用應(yīng)于免疫細胞實驗及免疫組織化學(xué)實驗，實驗發(fā)現(xiàn)FHL2主要在細胞核中表達，但細胞質(zhì)中有也少量表達。 結(jié)論： 本研究中通過分子克隆技術(shù)，在原核表達系統(tǒng)中，成功重組表達了FHL2，利用分離純化后的重組蛋白rhFHL2免疫新西蘭大白兔，成功獲得效價為1:12500(ELISA法)的抗FHL2的多克隆抗體血清，該抗體特異性強，用westernblotting檢測只有一條特異性條帶。后續(xù)實驗