馬鈴薯卷葉病毒CP基因的克隆、原核表達(dá)及抗血清的制備.pdf

1、本研究的目的是克隆馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)外殼蛋白(CP)基因并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，使其在大腸桿菌中高效表達(dá)，用表達(dá)的融合蛋白作為抗原制備抗血清，為進(jìn)一步制備PLRV的ELISA檢測(cè)試劑盒打基礎(chǔ)。 從感染PLRV的馬鈴薯病葉中提取總RNA并作模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得了PLRV-CP基因的特異性擴(kuò)增帶?；厥占s630bp的特異擴(kuò)增片段，然后進(jìn)行T-A克隆。經(jīng)PCR檢測(cè)及BamHⅠ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ限制性酶切鑒定，篩選

2、出了陽(yáng)性克隆，其重組質(zhì)粒被命名為。pGEM-LRCP。序列測(cè)定結(jié)果表明pGEM-LRCP中的插入片段就是PLRV-CP基因，長(zhǎng)627bp，編碼208個(gè)氨基酸。該基因與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的36個(gè)PLRV-CP基因相比，核苷酸序列的同源性高于96％，氨基酸序列的同源性均在97％以上。 以pGEM-LRCP為模板進(jìn)行PCR，獲得了PLRV-CP基因的擴(kuò)增產(chǎn)物(無(wú)終止密碼)，回收624bp的特異產(chǎn)物并與T表達(dá)載體pBAD/Thio-TOPO連

3、接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌TOP10獲得了Amp抗性菌落。經(jīng)PCR檢測(cè)及Bsp1407 Ⅰ與Nde Ⅰ的單酶切和雙酶切鑒定，篩選到了陽(yáng)性克隆，相應(yīng)的重組質(zhì)粒被命名為pBAD-LRCP。序列測(cè)定表明PLRV-CP基因與載體正向連接、密碼子閱讀正確，但構(gòu)建的工程菌TOP10(pBAD-LRCP)經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)后沒(méi)有預(yù)期的表達(dá)蛋白。 用pBAD-LRCP作模板，經(jīng)PCR，刪除了PLRV-CP基因中126bp的富含精氨酸密碼的DNA片段，獲

4、得了帶有突變基因的質(zhì)粒pBAD-LRCP-126。在37℃，缺失突變體TOP10(pBAD-LRCP-126)用0.2％阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)后，SDS-PAGE顯示蛋白圖譜上有一條34 kDa的特異性蛋白條帶，其大小與預(yù)期的融合蛋白相符。Western blotting分析結(jié)果顯示該融合蛋白與國(guó)際馬鈴薯中心(CIP)提供的PLRV-IgG有反應(yīng)，形成明顯的雜交帶，表明該融合蛋白是突變基因正確表達(dá)的產(chǎn)物。 用溶菌酶裂解菌體，提取