馬鈴薯卷葉病毒CP基因的突變、原核表達及抗血清制備.pdf

1、本研究的目的是實現(xiàn)馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)外殼蛋白(CP)突變基因在大腸桿菌中的高效表達，并用表達的融合蛋白作為抗原制備抗血清，為進行PLRV的ELISA檢測及組裝ELISA檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:
　　 1、采用人工合成DNA的方法對馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白(CP)基因的密碼子進行了突變。合成了含有PLRV-CP基因第39-624核苷酸的639bp的Bsp1407I-MssI片段，將該基因第52-177這段序列

2、(126bp)中精氨酸的稀有密碼子進行了同義與錯義突變。合成的DNA片段連接在pMD19-T載體上獲得了重組質(zhì)粒pMD-LRCP2。
　　 2、構(gòu)建了密碼子突變基因(LRCP2)的原核表達載體。將本實驗室已構(gòu)建的PLRV-CP缺失突變基因的原核表達載體pBAD-LRCP-126進行Bsp1407I與MssI雙酶切后回收4.5Kb的片段，pMD-LRCP2同樣雙酶切后回收0.64Kb的片段，兩個片段連接獲得了重組質(zhì)粒pBAD-LR

3、CP2，即獲得了突變基因LRCP2的原核表達載體。測序結(jié)果顯示基因的突變符合實驗設(shè)計的要求、基因與載體的連接正確。
　　 3、實現(xiàn)了突變基因(LRCP2)的原核表達。在37℃，大腸桿菌工程株TOP10(pBAD-LRCP2)用0.2％阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，SDS-PAGE顯示蛋白圖譜上有一條36 kDa的誘導(dǎo)表達蛋白條帶，其大小與預(yù)期的融合蛋白相符，表明該突變基因?qū)崿F(xiàn)了在PBAD驅(qū)動下的原核誘導(dǎo)表達。
　　 4、對PL

4、RV-CP缺失突變基因進行原核表達獲得了大量融合蛋白。TOP10（pBAD-LRCP-126）經(jīng)誘導(dǎo)、蛋白提取與鎳離子親和層析獲得了大量高純度的融合蛋白。
　　 5、制備出了融合蛋白特異性抗血清。以純化的融合蛋白為抗原免疫家兔制備出了特異性抗血清，間接ELISA檢測顯示效價可達1∶12000。
　　 6、對PLRV進行了間接ELISA檢測。用制備的抗血清對感染PLRV的病葉組織進行間接ELISA檢測，結(jié)果呈陽性，結(jié)果表明