PJ34對渥曼青霉素誘導(dǎo)的小鼠空間記憶障礙的保護作用及其機制研究.pdf

1、過度磷酸化的tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的早期病理特征之一。Tau蛋白的過度磷酸化是由于蛋白激酶和蛋白酯酶失調(diào)引起的,其中糖原合酶激酶-3(glycogensynthase kinase3,GSK-3)是引起tau蛋白過度磷酸化的主要激酶之一,它可以調(diào)節(jié)tau蛋白多個位點的磷酸化,從而促進AD的發(fā)生。用渥曼青霉素(

2、wortmannin,WT)激活GSK-3,可以導(dǎo)致小鼠tau蛋白的過度磷酸化和空間記憶功能障礙,復(fù)制AD模型小鼠,但在AD病人腦中引起GSK-3激活的上游因素還不十分清楚。有報道表明聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)可以激活GSK-3,在AD腦中PARP-1的含量升高,PARP-1基因的表達水平也升高。因此我們推測PARP-1可能作為GSK-3的一個上游因素通過激活

3、GSK-3促進AD的發(fā)生。
　　 本實驗中,我們首先用WT復(fù)制tau蛋白過度磷酸化和空間記憶障礙的小鼠急性AD模型,在給予WT前2 h或后2 h側(cè)腦室注射PARP-1的抑制劑-PJ34,分別觀察對小鼠空間記憶和tau蛋白過度磷酸化的影響；同時在細胞水平觀察PJ34對tau蛋白磷酸化的影響,GSK-3及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB／Akt)的活性改變并探討其分子機制。結(jié)果如下:(1)PJ34對AD模型小鼠空

4、間記憶障礙具有保護作用。Morris水迷宮成績顯示,給予WT后,小鼠找到平臺的潛伏期明顯變長,空間記憶損傷；之后再注射PJ34可以部分改善小鼠的空間記憶障礙,提前給予PJ34可以預(yù)防再注射WT引起的小鼠空間記憶損傷。(2)PJ34對AD模型小鼠海馬中tau蛋白磷酸化的影響。免疫組化結(jié)果顯示:WT組與對照組相比,在海馬CA1和CA3區(qū)域的tau-1(Ser195／198／199／202)位點的免疫反應(yīng)明顯減弱,因為tau-1檢測非磷酸化的

5、tau蛋白,其顯色減弱表明tau蛋白在Ser195／198／199／202位點的磷酸化增強；WT+PJ34組和PJ34+WT組在海馬CA1和CA3區(qū)域的tau-1抗體的顯色明顯比WT組增強；tau蛋白在Thr231,Ser396,Thr205位點免疫組化結(jié)果也表明WT可以增強這些位點的磷酸化,PJ34可以減輕這些位點的磷酸化,但在tau-Ser214位點,不同處理對tau蛋白磷酸化水平結(jié)果與tau蛋白Thr231,Ser396,Thr2

6、05位點結(jié)果相反。(3)為了進一步探討PJ34對tau蛋白磷酸化的影響及其分子機制,我們在細胞水平用不同濃度的PJ34作用于穩(wěn)定表達人tau441異構(gòu)體的人腎母瘤細胞株(humanembryonic kidney293 cells,HEK293／tau441)24 h。免疫印跡結(jié)果顯示:tau蛋白的總體表達水平不變,非磷酸化的tau蛋白在tau-1(Ser195／198／199／202)顯色增強,tau蛋白在Thr231,Ser396,

7、Thr205位點磷酸化水平明顯下降,但是tau蛋白Ser214位點的磷酸化水平明顯增加。(4)我們進一步檢測引起tau蛋白過度磷酸化作用的激酶GSK-3活性的變化。免疫印跡結(jié)果顯示:GSK-3總體水平不變,但GSK-3-Ser9位點磷酸化增強,說明PJ34抑制GSK-3的活性；Akt的活性檢測結(jié)果顯示,Akt總體水平不變,但Akt-Ser473位點磷酸化增強,說明PJ34上調(diào)Akt活性。(5)尼氏染色的結(jié)果顯示:與對照組相比,WT注射組

8、小鼠海馬尼氏體數(shù)目明顯減少；而后2 h給予PJ34可以恢復(fù)到正常水平,在給予WT前2 h給予PJ34可以抑制WT導(dǎo)致的尼氏體數(shù)目下降。(6)有報道顯示W(wǎng)T可能損傷神經(jīng)元的突起和樹突棘的結(jié)構(gòu)和功能。因此我們檢測了PJ34對AD模型小鼠海馬神經(jīng)元突起和樹突棘的影響。Golgi染色結(jié)果顯示:WT可以使神經(jīng)元突起數(shù)目減少,樹突棘數(shù)目下降,同時神經(jīng)元突起的形態(tài)變得不規(guī)則,斷斷續(xù)續(xù)。PJ34則可以對抗WT所引起這種對神經(jīng)元突起和樹突棘的損傷作用。(