渥曼青霉素對(duì)LPS-D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷中肝組織壞死、凋亡及自噬的影響.pdf

1、目的:
　　眾所周知，腸道是人體最大的“儲(chǔ)菌所”，在人體腸道內(nèi)寄生著500-1000種共計(jì)100萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌（這些細(xì)菌影響著人的消化能力和免疫功能，對(duì)人體的健康非常重要）。其中的革蘭氏陰性菌死亡的時(shí)候會(huì)釋放內(nèi)毒素，因此腸道也是人體最大的“內(nèi)毒素庫(kù)”。由腸源性內(nèi)毒素引發(fā)的急性肝損傷是臨床上導(dǎo)致肝臟功能衰竭的常見(jiàn)原因之一。LPS作為內(nèi)毒素的主要成分，通過(guò)腹腔注射到小鼠體內(nèi)，能夠很好的模擬腸源性內(nèi)毒素發(fā)生感染的過(guò)程，而D-GalN能夠特異

2、性的消耗肝臟內(nèi)的UTP，從而抑制相應(yīng)的核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷甚至死亡。LPS與D-GalN的聯(lián)合注射能夠特異性的造成肝臟的暴發(fā)性衰竭，是研究急性肝損傷的很好的動(dòng)物模型。
　　自噬是一種在所有真核細(xì)胞中都穩(wěn)定存在的，以一種雙分子膜包裹著細(xì)胞質(zhì)成分成為自噬體，隨后這些結(jié)構(gòu)和溶酶體融合，遞送的“貨物”被降解和回收的過(guò)程，是對(duì)發(fā)育、分化、生存以及穩(wěn)態(tài)起重要作用的胞內(nèi)途徑。在過(guò)去的十多年中，其在人類(lèi)疾病中的作用被廣泛

3、關(guān)注。最近數(shù)據(jù)表明自噬參與多種肝臟疾病的發(fā)生。然而關(guān)于自噬在急性肝損傷中的作用的報(bào)道卻很少而且結(jié)果也不一致。
　　渥曼青霉素是一種自繩狀青霉中分離出來(lái)的抗真菌類(lèi)抗生素，它沒(méi)有抗細(xì)菌能力，只特異性地作用于真菌。很多文獻(xiàn)報(bào)道渥曼青霉素能夠在體內(nèi)外抑制自噬。本課題的目的是擬探討LPS/D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷中肝組織壞死、凋亡及自噬的改變及采用渥曼青霉素預(yù)處理對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷中肝組織壞死、凋亡及自噬的影響。通過(guò)本研

4、究的完成，不僅可以進(jìn)一步闡明LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠發(fā)生急性肝損傷的分子機(jī)制，還可以為開(kāi)發(fā)臨床上治療腸源性內(nèi)毒素引發(fā)的急性肝損傷的藥物提供借鑒價(jià)值。
　　方法:
　　一、脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)小鼠的急性肝損傷情況
　　利用脂多糖/D-半乳糖胺腹腔注射到野生型C57BL/6小鼠體內(nèi)，建立小鼠的急性肝損傷內(nèi)毒素誘導(dǎo)模型，在誘導(dǎo)3小時(shí)以及5小時(shí)后處死小鼠，收集血清、肝組織進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。
　　1.利用醫(yī)用全自

5、動(dòng)生化分析儀器對(duì)各小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.采用蘇木素伊紅(HE)染色方法對(duì)肝組織切片進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，并利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定(TUNEL)檢測(cè)肝組織的凋亡情況。
　　3.采用免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）和免疫蛋白印跡(westernblot)方法檢測(cè)肝組織中caspase-3的活化水平。
　　二

6、、脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)急性肝損傷過(guò)程中肝組織自噬水平的變化
　　1.采用免疫蛋白印跡方法檢測(cè)肝臟自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-Ⅱ的表達(dá)水平變化。
　　2.采用免疫組織熒光染色方法檢測(cè)肝臟中自噬小體形成的變化情況。
　　三、脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)急性肝損傷過(guò)程中炎性細(xì)胞因子的分泌情況
　　1.利用BD公司開(kāi)發(fā)的基于流式細(xì)胞儀的液相蛋白定量技術(shù)(BDTM CytometricBead Array(CBA) System)

7、對(duì)血清中TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10等炎性細(xì)胞因子的含量進(jìn)行檢測(cè)，另采用酶聯(lián)免疫吸附方法對(duì)血清中IL-1β的含量進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.采用RT-PCR方法對(duì)肝臟組織中以上各種炎性細(xì)胞因子(Tnfa、Mcp1、Il1β、Il6、Il10)的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　四、渥曼青霉素預(yù)處理對(duì)小鼠急性肝損傷以及肝組織中炎性細(xì)胞因子分泌的影響
　　在注射脂多糖/D-半乳糖胺前1小時(shí)，將渥曼青霉素以同樣的方式注

8、射到小鼠體內(nèi)，然后再注射脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)肝損傷，然后在誘導(dǎo)5小時(shí)后，處死小鼠，收集血清、肝組織再進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。
　　1.測(cè)定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量，統(tǒng)計(jì)分析渥曼青霉素對(duì)小鼠肝臟功能的影響。
　　2.蘇木素伊紅染色檢測(cè)肝臟組織的病理學(xué)損傷，并同樣進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定，來(lái)探究渥曼青霉素對(duì)肝細(xì)胞壞死和凋亡的影響。
　　3.免疫組織化學(xué)染色和免疫蛋白印跡檢測(cè)分

9、析肝組織中caspase-3活化水平受渥曼青霉素的影響。
　　4.RT-PCR檢測(cè)肝臟中以上各種炎性細(xì)胞因子的mRNA水平變化，以明確渥曼青霉素對(duì)肝組織中炎性細(xì)胞因子分泌的影響。
　　五、渥曼青霉素預(yù)處理對(duì)肝組織自噬水平的影響
　　1.免疫蛋白印跡檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-Ⅱ的表達(dá)變化，以探究渥曼青霉素對(duì)肝臟中自噬水平的影響。
　　2.免疫組織熒光染色檢測(cè)分析渥曼青霉素對(duì)肝臟中自噬小體形成的影響。
　　六、渥

10、曼青霉素預(yù)處理對(duì)肝組織中MAPK及NF-κB信號(hào)通路活化的影響
　　1.采用免疫蛋白印跡方法對(duì)肝臟內(nèi)MAPK通路中ERK、JNK、p38的活化情況即磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.采用免疫蛋白印跡方法對(duì)肝臟內(nèi)NF-κB通路中p65的活化情況即磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　一、脂多糖/D-半乳糖胺能誘導(dǎo)小鼠的急性肝損傷，造成肝組織的壞死和凋亡
　　1.小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，在被誘導(dǎo)肝損

11、傷3小時(shí)后并沒(méi)有變化，但在誘導(dǎo)5小時(shí)后明顯升高。
　　2.小鼠的肝組織，在被誘導(dǎo)損傷3小時(shí)后開(kāi)始出現(xiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血，而在誘導(dǎo)5小時(shí)后出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有嚴(yán)重的充血。
　　3.肝臟內(nèi)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，在被誘導(dǎo)損傷3小時(shí)后有少量出現(xiàn)，但在誘導(dǎo)5小時(shí)后明顯增多;另外caspase-3在被誘導(dǎo)3小時(shí)后沒(méi)有活化，但在誘導(dǎo)5小時(shí)后明顯活化。
　　二、在脂多糖/D-半乳糖胺導(dǎo)致小鼠急性肝損傷過(guò)程中肝組織中的自噬水

12、平升高
　　1.小鼠肝臟內(nèi)LC3B-Ⅱ的表達(dá)在被誘導(dǎo)損傷3小時(shí)后沒(méi)有變化，但在誘導(dǎo)5小時(shí)后明顯升高。
　　2.肝臟內(nèi)自噬小體在被誘導(dǎo)損傷3小時(shí)后就已經(jīng)開(kāi)始形成，在誘導(dǎo)5小時(shí)后，形成明顯增多。
　　三、在脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中炎性細(xì)胞因子分泌增加
　　1.小鼠血清中TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10等炎性細(xì)胞因子的水平在被誘導(dǎo)肝損傷3小時(shí)以及5小時(shí)后均明顯升高。
　　2.小鼠肝臟

13、中Tnfa、Mcp1、Il1β、Il6、Il10等炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平在被誘導(dǎo)損傷3小時(shí)以及5小時(shí)后也均明顯增加。
　　四、渥曼青霉素預(yù)處理能夠減輕脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷過(guò)程中肝臟的損傷程度，抑制炎性細(xì)胞因子的分泌
　　1.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預(yù)處理組小鼠的血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量明顯降低。
　　2.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預(yù)處理組小鼠肝臟內(nèi)充血和炎性細(xì)

14、胞浸潤(rùn)明顯減少，病理學(xué)損傷明顯改善。
　　3.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預(yù)處理組小鼠肝臟內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，caspase-3的活化水平明顯降低。
　　4.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預(yù)處理組小鼠肝臟內(nèi)除Mcp1之外的Tnfa、Il1β、Il6、Il10等炎性細(xì)胞因子的mRNA的水平明顯降低。
　　五、渥曼青霉素預(yù)處理能夠抑制脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷過(guò)程中肝組織自噬水平的升高

15、>　　1.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預(yù)處理組小鼠肝組織中自噬水平的升高明顯被抑制，回歸未誘導(dǎo)肝損傷之前的本底水平。
　　2.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預(yù)處理組小鼠肝組織中自噬小體的形成也明顯減少。
　　六、預(yù)注射渥曼青霉素能夠抑制脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷過(guò)程中肝組織內(nèi)MAPK和NF-κB通路的活化
　　1.相比于未預(yù)注射渥曼青霉素組，預(yù)注射渥曼青霉素組小鼠肝組織內(nèi)pJNK、p38活化

16、水平?jīng)]有變化，但pERK活化水平受到抑制。
　　2.相比于未預(yù)注射渥曼青霉素組，預(yù)注射渥曼青霉素組小鼠肝組織內(nèi)p65的活化水平受到抑制。
　　結(jié)論及意義:
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷過(guò)程中，脂多糖/D-半乳糖胺不僅能通過(guò)誘導(dǎo)Tnfa等炎性細(xì)胞因子的分泌導(dǎo)致肝組織的壞死和凋亡，還能導(dǎo)致自噬水平的升高。然而，渥曼青霉素預(yù)處理可抑制自噬，與此同時(shí)，渥曼青霉素還能降低炎性細(xì)胞因子的水平，減輕

17、肝組織的壞死和凋亡，并最終減輕肝臟的損傷程度。但因?yàn)殇茁嗝顾夭⒎亲允傻奶禺愋砸种苿?，我們并不能確定是否是由于渥曼青霉素抑制了自噬從而使得肝組織壞死、凋亡以及肝損傷減輕的。
　　我們的研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)了渥曼青霉素能夠在體內(nèi)有效的減輕脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的小鼠的急性肝損傷，這為臨床上研發(fā)治療腸源性內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肝損傷的藥物提供了重要的借鑒意義;另外我們還發(fā)現(xiàn)自噬在該過(guò)程中有可能起著重要的作用，這對(duì)進(jìn)一步探究腸源性內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急