反義抑制PCR檢測結核桿菌耐利福平變異菌株方法以及臨床應用的研究.pdf

1、結核分枝桿菌(Mycobacterium Tu berculosis,MTB),是由德國科學家Koch于1882年發(fā)現(xiàn),并證明其為結核病的病原體。隨著衛(wèi)生狀況的改善以及抗結核藥物的不斷發(fā)展,曾令結核病的發(fā)病率和病死率大幅度下降,然而80年代后,由于艾滋病(AIDS)的流行使結核病再度活躍。近年來,結核病的疫情呈現(xiàn)復蘇的趨勢,儼然成為傳染病中的頭號殺手和首要死亡病因。
　　利福平(RFP)是通過特異地與RNA聚合酶β亞基結合,從而抑

2、制RNA聚合酶活性,并干擾分枝桿菌RNA的轉錄及合成,最終阻礙蛋白質合成來發(fā)揮抗菌作用的。研究表明,90％以上結核桿菌耐RFP都是由于其作用的靶分子RNA多聚酶β亞單位的編碼基因(rpoB)發(fā)生突變所致。
　　目前檢測結核分枝桿菌主要依靠涂片、培養(yǎng)加藥敏、PCR技術等多項傳統(tǒng)試驗進行綜合分析,其操作復雜、耗時長,敏感以及特異性差,易導致誤診和漏診的發(fā)生,延誤治療的同時又加重了病人額外的經(jīng)濟負擔。
　　本實驗采用反義抑制PCR

3、的方法,檢測結核桿菌rpoB基因531以及526位點的突變,顯示當野生反義上游引物的濃度大于10μM時,可完全抑制野生型質粒DNA的PCR擴增;在此條件下,觀察到最低檢出濃度為1-5×103(IU/ml),其性能完全可以滿足臨床標本檢測的需要。
　　使用本方法對臨床182例結核病患者進行檢測,并與傳統(tǒng)的培養(yǎng)加藥敏法,以及PCR直接測序法結果進行比較。結果顯示本方法、藥敏法以及直接測序法所測得有rpoB基因突變分別為64例,63例,