反義抑制PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌耐利福平變異菌株方法以及臨床應(yīng)用的研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tu berculosis,MTB),是由德國(guó)科學(xué)家Koch于1882年發(fā)現(xiàn),并證明其為結(jié)核病的病原體。隨著衛(wèi)生狀況的改善以及抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展,曾令結(jié)核病的發(fā)病率和病死率大幅度下降,然而80年代后,由于艾滋病(AIDS)的流行使結(jié)核病再度活躍。近年來(lái),結(jié)核病的疫情呈現(xiàn)復(fù)蘇的趨勢(shì),儼然成為傳染病中的頭號(hào)殺手和首要死亡病因。
　　利福平(RFP)是通過(guò)特異地與RNA聚合酶β亞基結(jié)合,從而抑

2、制RNA聚合酶活性,并干擾分枝桿菌RNA的轉(zhuǎn)錄及合成,最終阻礙蛋白質(zhì)合成來(lái)發(fā)揮抗菌作用的。研究表明,90％以上結(jié)核桿菌耐RFP都是由于其作用的靶分子RNA多聚酶β亞單位的編碼基因(rpoB)發(fā)生突變所致。
　　目前檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌主要依靠涂片、培養(yǎng)加藥敏、PCR技術(shù)等多項(xiàng)傳統(tǒng)試驗(yàn)進(jìn)行綜合分析,其操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),敏感以及特異性差,易導(dǎo)致誤診和漏診的發(fā)生,延誤治療的同時(shí)又加重了病人額外的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　本實(shí)驗(yàn)采用反義抑制PCR

3、的方法,檢測(cè)結(jié)核桿菌rpoB基因531以及526位點(diǎn)的突變,顯示當(dāng)野生反義上游引物的濃度大于10μM時(shí),可完全抑制野生型質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增;在此條件下,觀察到最低檢出濃度為1-5×103(IU/ml),其性能完全可以滿(mǎn)足臨床標(biāo)本檢測(cè)的需要。
　　使用本方法對(duì)臨床182例結(jié)核病患者進(jìn)行檢測(cè),并與傳統(tǒng)的培養(yǎng)加藥敏法,以及PCR直接測(cè)序法結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示本方法、藥敏法以及直接測(cè)序法所測(cè)得有rpoB基因突變分別為64例,63例,