兒童耐多藥結(jié)核桿菌差異表達(dá)基因的篩選及克隆.pdf

1、目的：本研究擬避開(kāi)傳統(tǒng)在已知結(jié)核菌耐藥相關(guān)基因中一一進(jìn)行探索的實(shí)驗(yàn)方法，直接從基因差異表達(dá)角度入手，就可能參與調(diào)控結(jié)核菌耐多藥性產(chǎn)生的基因進(jìn)行一次橫向、大范圍的篩選；了解兒童結(jié)核桿菌耐多藥調(diào)節(jié)機(jī)制與成人的異同點(diǎn)。
　　方法：收集我院感染消化科從2003年7月～2010.12月所有培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核菌株，在已進(jìn)行耐藥鑒定和基因分型的基礎(chǔ)上，以耐多藥菌株cDNA為實(shí)驗(yàn)組(Tester)，敏感株cDNA為驅(qū)動(dòng)組(Driver)，應(yīng)用抑制消減

2、雜交(SSH)技術(shù)結(jié)合T/A克隆技術(shù)構(gòu)建族耐多藥與敏感菌株差異表達(dá)消減cDNA文庫(kù)，利用Blastn軟件將所獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank進(jìn)行同源性分析。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)兩次消減雜交及PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)“A/T clone”克隆到PMD-18T載體，轉(zhuǎn)染至感受態(tài)大腸桿菌DH5，所長(zhǎng)出的菌落中約90％為白色菌落，成功構(gòu)建耐多藥結(jié)核桿菌cDNA消減文庫(kù)。經(jīng)PCR鑒定約80％有特異性擴(kuò)增帶且擴(kuò)增帶分子量在2

3、00～1000bp之間，陽(yáng)性率較高。隨即挑選248個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行基因測(cè)序，經(jīng)同源性分析去除無(wú)效及重復(fù)序列，共獲得113個(gè)差異表達(dá)cDNA片段，其中有5條未知EST序列，其余108個(gè)均為已知基因(5個(gè)參與結(jié)核耐藥的形成)，其主要功能分類主要為：①細(xì)胞壁及相關(guān)過(guò)程蛋白基因，如Rv0987，Rv3783，Rv2318；②PPE家族蛋白相關(guān)基因，如Rv3343c PPE54，Rv1918c PPE35；③參與中間代謝和呼吸活動(dòng)相關(guān)基因，如Rv3

4、858c Rv3784，Rv3068c；④與結(jié)核桿菌毒力，解毒作用及其適應(yīng)性相關(guān)基因，如Rv2477cRv0783c Rv2303c；⑤細(xì)菌脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，如Rv2933 Rv2931Rv3515c；⑥調(diào)控相關(guān)蛋白，如Rv3765c Rv2799c Rv0984；⑦假想蛋白，如Rv1498A Rv2603 Rv0690c及一些信號(hào)通路、調(diào)節(jié)蛋白和插入序列等。
　　結(jié)論：研究表明SSH技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因和新功能基因的有效方法；