結(jié)核桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法及間接ELISA檢測(cè)方法的研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性人畜共患病。據(jù)估計(jì)，全球約有1/3的人口被結(jié)核感染，準(zhǔn)確、及時(shí)地對(duì)結(jié)核患者進(jìn)行診斷是治療和控制結(jié)核所必需的。結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)是臨床診斷結(jié)核常用的方法，也是國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織與我國(guó)認(rèn)可的法定檢疫方法。但由于結(jié)核菌素可能包含有與其它分枝桿菌相同的抗原組份,檢測(cè)時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,并且此檢測(cè)不能區(qū)分自然感染者與卡介苗免疫者。此外還有很多結(jié)核病的診斷方法如細(xì)菌培養(yǎng)、痰檢、PCR、IFN-Y診斷法等,但這些方法的缺點(diǎn)是

2、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),操作煩瑣,需要昂貴的儀器設(shè)備,而且要有專(zhuān)門(mén)的人進(jìn)行操作等,因此不利于結(jié)核病的檢測(cè)?；谝陨显颍緦?shí)驗(yàn)研究了兩種新型的結(jié)核檢測(cè)方法：
　　 一、建立一種快速、高敏感、高特異、鑒別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的方法。實(shí)驗(yàn)根據(jù)大多數(shù)致病性結(jié)核分枝桿菌共有序列esat-6,結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌gyrB共有特異性序列，以及結(jié)核分枝桿菌種特異序列mtp40設(shè)計(jì)6對(duì)特異性引物對(duì)痰液中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)，并與鑒別培養(yǎng)基分離培養(yǎng)

3、結(jié)果以及常規(guī)PCR鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的LAMP檢測(cè)方法具有很高的特異性?？蓞^(qū)分致病性結(jié)核分枝桿菌和非致病結(jié)核分枝桿菌，也可鑒別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。LAMP檢測(cè)技術(shù)的靈敏度比經(jīng)典PCR技術(shù)高100倍左右，可檢測(cè)到7拷貝/反應(yīng)。另外,用三種方法檢測(cè)樣品發(fā)現(xiàn)，LAMP與細(xì)菌培養(yǎng)的符合率為90.91％，LAMP與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率為100％。該檢測(cè)方法可以在流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場(chǎng)快速診斷方面廣泛應(yīng)用,并為臨床治療提供

4、依據(jù)。
　　 二、采用多抗原組合的方法建立一種特異性高，靈敏度好的結(jié)核血清學(xué)診斷方法。利用分子生物學(xué)方法克隆、表達(dá)抗原蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c，并用蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。將四種蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c按1：1：1：1組合，作為診斷抗原來(lái)檢測(cè)血清中的結(jié)核抗體。最終以ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c作為診斷抗原建立了間接ELISA方法,并確定了ELISA診斷方

5、法的判定標(biāo)準(zhǔn),即S/P≥0.235為陽(yáng)性,S/P<0.202為陰性,0.235>S/P≥0.202為可疑。ELISA方法的特異性為95.8.％、敏感性為65.0％。對(duì)20份痰檢陽(yáng)性和120份健康人血清樣品進(jìn)行了檢測(cè),并與痰檢結(jié)果比較。20份痰檢陽(yáng)性血清樣品中有13份為ELISA檢測(cè)陽(yáng)性,陽(yáng)性符合率為65.0％,120份健康人血清，5份為陽(yáng)性，其余為陰性，陰性符合率為95.8％,本ELISA方法與痰檢診斷方法總符合率為91.4％。研究表明