耐多藥結(jié)核桿菌基因突變檢測(cè)膜芯片的研究.pdf

1、本研究以結(jié)核分枝桿菌耐藥基因katG、inhA、oxyR-ahpC、rpoB、rpsL、rrs、embB、pncA、gyrA為靶點(diǎn)，自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物與寡核苷酸探針，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一反向點(diǎn)雜交法，構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌多耐藥基因檢測(cè)膜芯片. 目的：構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌多耐藥基因檢測(cè)膜芯片，建立一種快速、簡(jiǎn)便的結(jié)核桿菌耐藥性的檢測(cè)方法。 方法：1、通過文獻(xiàn)查詢結(jié)核桿菌耐藥基因katG、inhA、oxyR-ahpC、rpoB、rps

2、L、rrs、embB、pncA、gyrA常見引起耐藥的突變位點(diǎn)，并統(tǒng)計(jì)與分析，設(shè)計(jì)12對(duì)引物擴(kuò)增包含上述常見耐藥突變位點(diǎn)的耐藥基因片段，設(shè)計(jì)59條寡核苷酸檢測(cè)探針，在NCBI上BLAST分析引物及探針的特異性； 2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增結(jié)核桿菌耐藥基因，從退火溫度、引物濃度等兩方面探討單基因PCR條件的優(yōu)化；從退火溫度、引物濃度、Buffer加入量等三方面探討多重PCR條件的優(yōu)化； 3、利用膜芯片雜交技術(shù)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)

3、物的耐藥情況，并從雜交溫度、探針濃度、雜交時(shí)間、洗膜時(shí)間、顯色時(shí)間五方面來進(jìn)行雜交條件的優(yōu)化研究。 結(jié)果：1、BLAST分析結(jié)果顯示引物及探針序列均特異； 2、確定單基因PCR的最適條件為：退火溫度為61℃，引物濃度為10μ M、力口入量0.5 μ 1； 3、確定多重PCR的最適條件為：退火溫度為61℃，引物濃度為10 μM、加入量為0.5～0.8 μ 1，10×Buffer加入量為2 μ 1或4 μ 1；

4、 4、雜交的最適條件為：雜交溫度為50℃；探針濃度為5 μ M；雜交時(shí)間為4h；洗膜溫度及時(shí)間為50℃、5～8min；顯色時(shí)間20min。 結(jié)論：1、建立結(jié)核桿菌耐藥基因多重PCR反應(yīng)體系，可在相同的反應(yīng)條件下同時(shí)擴(kuò)增9個(gè)抗結(jié)核一線藥物耐受基因； 2、初步構(gòu)建了結(jié)核桿菌多耐藥基因檢測(cè)膜芯片； 3、膜芯片以尼龍膜為載體，手工點(diǎn)膜，無需特殊的芯片點(diǎn)樣儀，并以生物素代替熒光、放射性同位素作為標(biāo)記，通過酶聯(lián)顯色系統(tǒng)進(jìn)行