皮膚分枝桿菌感染快速診斷和藥敏試驗方法的研究和應(yīng)用.pdf

1、近年來隨著免疫抑制劑應(yīng)用的增多、器官移植手術(shù)普及以及免疫相關(guān)性疾病如艾滋病的流行，分枝桿菌感染與日俱增。皮膚分枝桿菌感染的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，往往需要借助實驗室檢查，傳統(tǒng)的檢查方法包括分枝桿菌鏡檢、培養(yǎng)和組織病理。但是由于目前的實驗室檢查方法敏感性較低、耗時長、特異性較差，容易造成漏診和誤診。PCR技術(shù)能夠快速、特異、敏感地進(jìn)行分子診斷，逐漸被廣泛應(yīng)用于分枝桿菌檢測，然而PCR技術(shù)在此領(lǐng)域應(yīng)用也有待改進(jìn)。近來出現(xiàn)了一種新的核酸擴增技術(shù)，

2、即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediatea isothermal amplification，LAMP），它采用獨特的引物設(shè)計實現(xiàn)等溫條件下的核酸快速擴增。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，該方法操作簡單，快速靈敏，并且不需要特殊的儀器設(shè)備，尤其適合在基層醫(yī)療單位推廣。
　　 隨著結(jié)核耐藥菌株的逐漸增多，以及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌（NTM）對常用的抗結(jié)核藥物呈高度耐藥，根據(jù)分枝桿菌藥敏結(jié)果選擇治療方案，對指導(dǎo)臨床治療具有重大意義。傳統(tǒng)藥敏試

3、驗（絕對濃度法和比例法）操作繁雜、費時較長且穩(wěn)定性差，很難滿足臨床需要。而2003年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）制定的《分枝桿菌藥敏試驗通過標(biāo)準(zhǔn)》（CLSI M24-A）采用標(biāo)準(zhǔn)化的液基微量稀釋法進(jìn)行藥敏試驗，具有操作相對簡便、不需要特殊設(shè)備、準(zhǔn)確性高及重復(fù)性好的特點，可以篩選有效的新型抗菌藥物。
　　 海魚分枝桿菌是一種見光產(chǎn)色的慢生型分枝桿菌，存在于淡水或咸水中，可導(dǎo)致多種魚類患病。人類在接觸了養(yǎng)魚池、在污染的水中

4、捕魚或游泳時易被感染，因此常被描述為游泳池肉芽腫或養(yǎng)魚池肉芽腫。雖然海魚分枝桿菌感染常有文獻(xiàn)報道，但是關(guān)于對其爆發(fā)感染的研究甚少。
　　 本研究：①根據(jù)CLSI M24-A標(biāo)準(zhǔn)，在我們實驗室建立起針對結(jié)核分枝桿菌、慢生型NTM和快生型NTM的液基微量稀釋法，與國際標(biāo)準(zhǔn)水平接軌；并進(jìn)一步采用該方法對我所近年來皮膚標(biāo)本中分離出的結(jié)核菌和NTM臨床株進(jìn)行藥敏分析；同時評價常見分枝桿菌對氨苯砜和氯法齊明的體外實驗敏感性。②建立起檢測結(jié)核

5、分枝桿菌的LAMP方法，初步探討其在皮膚結(jié)核組織標(biāo)本中的應(yīng)用價值。③對江蘇海安某漁廠進(jìn)行調(diào)查研究海魚分枝桿菌皮膚感染的小爆發(fā)狀況，并給予感染患者含克拉霉素的治療方案，觀察其臨床療效。
　　 本研究論文全文分為三章：
　　 第一章液基微量稀釋法體外測定常見分枝桿菌的藥物敏感性
　　 目的評價結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性。方法根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會推薦的M24-A液基微量稀釋法，測定臨床結(jié)核和非結(jié)核分

6、枝桿菌對異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、鏈霉素（SM）、左氧氟沙星（LOFX）、阿米卡星（AMK）、多西環(huán)素（DCC）、克拉霉素（CTM）、磺胺甲基異噁唑（SMZ）、氨苯砜（DDS）和氯法齊明（CLO）等藥物的敏感性，其中結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果與傳統(tǒng)絕對濃度法進(jìn)行比較。同時測定常見分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株對氨苯砜和氯法齊明的體外敏感性。
　　 結(jié)果：8株臨床結(jié)核分枝桿菌中，除1株菌對SM耐藥外，各株菌對INH、RFP、

7、EMB、SM、LOFX五種藥物均敏感。3株源于臨床的海魚分枝桿菌中，除1株菌對DCC耐藥外，各株菌對RFP、AMK、DCC、CTM、SMZ五種藥物均敏感。1株臨床性胞內(nèi)分枝桿菌對CTM敏感。3株臨床性瘰癘分枝桿菌都對DCC耐藥，其中除1株菌同時對RFP和EMB耐藥外，各株菌對INH、RFP、EMB、SM、AMK、CTM、SMZ七種藥物均敏感。3株臨床性膿腫分枝桿菌中，除了1株菌同時對CTM和CLO敏感外，各株菌對LOFX、AMK、DCC

8、、CTM、SMZ、DDS、CLO七種藥物均表現(xiàn)為中間耐藥或耐藥。常見分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株均對DDS耐藥，結(jié)核、海魚和堪薩斯分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株對CLO敏感。結(jié)論不同分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性存在差異?？梢詤⒖俭w外藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥選擇。氯法齊明是一種治療結(jié)核、海魚和堪薩斯分枝桿菌感染有潛力的藥物。
　　 第二章環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌方法的建立與初步應(yīng)用
　　 目的建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測結(jié)核分枝桿菌的方法。方法針對結(jié)核分

9、枝桿菌復(fù)合群gyrB基因序列設(shè)計三對特征性引物，采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行65℃等溫擴增，1h后分析結(jié)果。確定該方法的敏感性和特異性，并初步探討其在皮膚結(jié)核組織標(biāo)本中的應(yīng)用。結(jié)果采用LAMP方法檢測結(jié)核分枝桿菌，敏感度與PCR相當(dāng)；與其他分枝桿菌無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。5例培養(yǎng)陽性臨床標(biāo)本中，LAMP和PCR方法敏感度均為2/5

10、。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測方法，不僅快速、特異、敏感，而且簡便價廉，適于在基層實驗室使用。
　　 第三章江蘇某漁廠海魚分枝桿菌感染爆發(fā)的調(diào)查研究
　　 背景海魚分枝桿菌是一種非結(jié)核光產(chǎn)色慢生型分枝桿菌，可導(dǎo)致人類皮膚感染。雖然海魚分枝桿菌感染常有文獻(xiàn)報道，但是關(guān)于其爆發(fā)感染的研究甚少。2008年11月我們在本院診治了一例來自江蘇海安市某漁廠的海魚分枝桿菌皮膚感染患者，問診得知該患者所在漁廠還有多例可疑類似患

11、者。方法我們前往該漁廠進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查，對疑似病例采集病史、體格檢查，完善相關(guān)檢查包括：胸片、常規(guī)組織病理學(xué)檢查及特殊染色、PPD試驗、潰瘍分泌物涂片抗酸染色、真菌培養(yǎng)、分枝桿菌培養(yǎng)及分子鑒定。綜合病史、既往治療情況、臨床表現(xiàn)及相關(guān)檢查，對患者進(jìn)行初步或最終診斷。然后給予患者克拉霉素單一治療或聯(lián)合復(fù)方磺胺甲基異惡唑治療，并隨訪觀察療效。結(jié)果經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，海魚分枝桿菌感染病例18例，男13例，女5例，病程2～55月。66.7％（12/18）的患

12、者有明確的被魚刺傷或咬傷史。所有患者均為肢端皮肽損害，其中2例表現(xiàn)為孢子絲菌病樣分布。受檢的13例患者中，僅7例組織學(xué)表現(xiàn)為感染性肉芽腫。分泌物涂片抗酸染色陽性率為4/9。PPD試驗陽性率為10/18。組織塊分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為3/8，培養(yǎng)物經(jīng)鑒定為海魚分枝桿菌。含克拉霉素的治療方案治愈率為72.2％（13/18）。治療過程中有4例出現(xiàn)治療抵抗，均發(fā)生于曾經(jīng)接受過局部皮質(zhì)激素封閉治療者。而未接受過局部封閉治療的患者，均未出現(xiàn)治療抵抗。結(jié)