皮膚分枝桿菌感染快速診斷和藥敏試驗(yàn)方法的研究和應(yīng)用.pdf

1、近年來(lái)隨著免疫抑制劑應(yīng)用的增多、器官移植手術(shù)普及以及免疫相關(guān)性疾病如艾滋病的流行，分枝桿菌感染與日俱增。皮膚分枝桿菌感染的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，往往需要借助實(shí)驗(yàn)室檢查，傳統(tǒng)的檢查方法包括分枝桿菌鏡檢、培養(yǎng)和組織病理。但是由于目前的實(shí)驗(yàn)室檢查方法敏感性較低、耗時(shí)長(zhǎng)、特異性較差，容易造成漏診和誤診。PCR技術(shù)能夠快速、特異、敏感地進(jìn)行分子診斷，逐漸被廣泛應(yīng)用于分枝桿菌檢測(cè)，然而PCR技術(shù)在此領(lǐng)域應(yīng)用也有待改進(jìn)。近來(lái)出現(xiàn)了一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，

2、即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatea isothermal amplification，LAMP），它采用獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)等溫條件下的核酸快速擴(kuò)增。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，該方法操作簡(jiǎn)單，快速靈敏，并且不需要特殊的儀器設(shè)備，尤其適合在基層醫(yī)療單位推廣。
　　 隨著結(jié)核耐藥菌株的逐漸增多，以及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌（NTM）對(duì)常用的抗結(jié)核藥物呈高度耐藥，根據(jù)分枝桿菌藥敏結(jié)果選擇治療方案，對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重大意義。傳統(tǒng)藥敏試

3、驗(yàn)（絕對(duì)濃度法和比例法）操作繁雜、費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)且穩(wěn)定性差，很難滿足臨床需要。而2003年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）制定的《分枝桿菌藥敏試驗(yàn)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)》（CLSI M24-A）采用標(biāo)準(zhǔn)化的液基微量稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、不需要特殊設(shè)備、準(zhǔn)確性高及重復(fù)性好的特點(diǎn)，可以篩選有效的新型抗菌藥物。
　　 海魚(yú)分枝桿菌是一種見(jiàn)光產(chǎn)色的慢生型分枝桿菌，存在于淡水或咸水中，可導(dǎo)致多種魚(yú)類(lèi)患病。人類(lèi)在接觸了養(yǎng)魚(yú)池、在污染的水中

4、捕魚(yú)或游泳時(shí)易被感染，因此常被描述為游泳池肉芽腫或養(yǎng)魚(yú)池肉芽腫。雖然海魚(yú)分枝桿菌感染常有文獻(xiàn)報(bào)道，但是關(guān)于對(duì)其爆發(fā)感染的研究甚少。
　　 本研究：①根據(jù)CLSI M24-A標(biāo)準(zhǔn)，在我們實(shí)驗(yàn)室建立起針對(duì)結(jié)核分枝桿菌、慢生型NTM和快生型NTM的液基微量稀釋法，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)水平接軌；并進(jìn)一步采用該方法對(duì)我所近年來(lái)皮膚標(biāo)本中分離出的結(jié)核菌和NTM臨床株進(jìn)行藥敏分析；同時(shí)評(píng)價(jià)常見(jiàn)分枝桿菌對(duì)氨苯砜和氯法齊明的體外實(shí)驗(yàn)敏感性。②建立起檢測(cè)結(jié)核

5、分枝桿菌的LAMP方法，初步探討其在皮膚結(jié)核組織標(biāo)本中的應(yīng)用價(jià)值。③對(duì)江蘇海安某漁廠進(jìn)行調(diào)查研究海魚(yú)分枝桿菌皮膚感染的小爆發(fā)狀況，并給予感染患者含克拉霉素的治療方案，觀察其臨床療效。
　　 本研究論文全文分為三章：
　　 第一章液基微量稀釋法體外測(cè)定常見(jiàn)分枝桿菌的藥物敏感性
　　 目的評(píng)價(jià)結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。方法根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦的M24-A液基微量稀釋法，測(cè)定臨床結(jié)核和非結(jié)核分

6、枝桿菌對(duì)異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、鏈霉素（SM）、左氧氟沙星（LOFX）、阿米卡星（AMK）、多西環(huán)素（DCC）、克拉霉素（CTM）、磺胺甲基異噁唑（SMZ）、氨苯砜（DDS）和氯法齊明（CLO）等藥物的敏感性，其中結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果與傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法進(jìn)行比較。同時(shí)測(cè)定常見(jiàn)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)氨苯砜和氯法齊明的體外敏感性。
　　 結(jié)果：8株臨床結(jié)核分枝桿菌中，除1株菌對(duì)SM耐藥外，各株菌對(duì)INH、RFP、

7、EMB、SM、LOFX五種藥物均敏感。3株源于臨床的海魚(yú)分枝桿菌中，除1株菌對(duì)DCC耐藥外，各株菌對(duì)RFP、AMK、DCC、CTM、SMZ五種藥物均敏感。1株臨床性胞內(nèi)分枝桿菌對(duì)CTM敏感。3株臨床性瘰癘分枝桿菌都對(duì)DCC耐藥，其中除1株菌同時(shí)對(duì)RFP和EMB耐藥外，各株菌對(duì)INH、RFP、EMB、SM、AMK、CTM、SMZ七種藥物均敏感。3株臨床性膿腫分枝桿菌中，除了1株菌同時(shí)對(duì)CTM和CLO敏感外，各株菌對(duì)LOFX、AMK、DCC

8、、CTM、SMZ、DDS、CLO七種藥物均表現(xiàn)為中間耐藥或耐藥。常見(jiàn)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株均對(duì)DDS耐藥，結(jié)核、海魚(yú)和堪薩斯分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)CLO敏感。結(jié)論不同分枝桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性存在差異?？梢詤⒖俭w外藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥選擇。氯法齊明是一種治療結(jié)核、海魚(yú)和堪薩斯分枝桿菌感染有潛力的藥物。
　　 第二章環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌方法的建立與初步應(yīng)用
　　 目的建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法。方法針對(duì)結(jié)核分

9、枝桿菌復(fù)合群gyrB基因序列設(shè)計(jì)三對(duì)特征性引物，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行65℃等溫?cái)U(kuò)增，1h后分析結(jié)果。確定該方法的敏感性和特異性，并初步探討其在皮膚結(jié)核組織標(biāo)本中的應(yīng)用。結(jié)果采用LAMP方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，敏感度與PCR相當(dāng)；與其他分枝桿菌無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。5例培養(yǎng)陽(yáng)性臨床標(biāo)本中，LAMP和PCR方法敏感度均為2/5

10、。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法，不僅快速、特異、敏感，而且簡(jiǎn)便價(jià)廉，適于在基層實(shí)驗(yàn)室使用。
　　 第三章江蘇某漁廠海魚(yú)分枝桿菌感染爆發(fā)的調(diào)查研究
　　 背景海魚(yú)分枝桿菌是一種非結(jié)核光產(chǎn)色慢生型分枝桿菌，可導(dǎo)致人類(lèi)皮膚感染。雖然海魚(yú)分枝桿菌感染常有文獻(xiàn)報(bào)道，但是關(guān)于其爆發(fā)感染的研究甚少。2008年11月我們?cè)诒驹涸\治了一例來(lái)自江蘇海安市某漁廠的海魚(yú)分枝桿菌皮膚感染患者，問(wèn)診得知該患者所在漁廠還有多例可疑類(lèi)似患

11、者。方法我們前往該漁廠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，對(duì)疑似病例采集病史、體格檢查，完善相關(guān)檢查包括：胸片、常規(guī)組織病理學(xué)檢查及特殊染色、PPD試驗(yàn)、潰瘍分泌物涂片抗酸染色、真菌培養(yǎng)、分枝桿菌培養(yǎng)及分子鑒定。綜合病史、既往治療情況、臨床表現(xiàn)及相關(guān)檢查，對(duì)患者進(jìn)行初步或最終診斷。然后給予患者克拉霉素單一治療或聯(lián)合復(fù)方磺胺甲基異惡唑治療，并隨訪觀察療效。結(jié)果經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，海魚(yú)分枝桿菌感染病例18例，男13例，女5例，病程2～55月。66.7％（12/18）的患

12、者有明確的被魚(yú)刺傷或咬傷史。所有患者均為肢端皮肽損害，其中2例表現(xiàn)為孢子絲菌病樣分布。受檢的13例患者中，僅7例組織學(xué)表現(xiàn)為感染性肉芽腫。分泌物涂片抗酸染色陽(yáng)性率為4/9。PPD試驗(yàn)陽(yáng)性率為10/18。組織塊分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為3/8，培養(yǎng)物經(jīng)鑒定為海魚(yú)分枝桿菌。含克拉霉素的治療方案治愈率為72.2％（13/18）。治療過(guò)程中有4例出現(xiàn)治療抵抗，均發(fā)生于曾經(jīng)接受過(guò)局部皮質(zhì)激素封閉治療者。而未接受過(guò)局部封閉治療的患者，均未出現(xiàn)治療抵抗。結(jié)