皮膚分枝桿菌感染快速診斷和藥敏試驗方法的研究和應用.pdf

1、近年來隨著免疫抑制劑應用的增多、器官移植手術普及以及免疫相關性疾病如艾滋病的流行，分枝桿菌感染與日俱增。皮膚分枝桿菌感染的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，往往需要借助實驗室檢查，傳統(tǒng)的檢查方法包括分枝桿菌鏡檢、培養(yǎng)和組織病理。但是由于目前的實驗室檢查方法敏感性較低、耗時長、特異性較差，容易造成漏診和誤診。PCR技術能夠快速、特異、敏感地進行分子診斷，逐漸被廣泛應用于分枝桿菌檢測，然而PCR技術在此領域應用也有待改進。近來出現(xiàn)了一種新的核酸擴增技術，

2、即環(huán)介導等溫擴增（loop-mediatea isothermal amplification，LAMP），它采用獨特的引物設計實現(xiàn)等溫條件下的核酸快速擴增。與傳統(tǒng)PCR技術相比，該方法操作簡單，快速靈敏，并且不需要特殊的儀器設備，尤其適合在基層醫(yī)療單位推廣。
　　 隨著結核耐藥菌株的逐漸增多，以及大多數(shù)非結核分枝桿菌（NTM）對常用的抗結核藥物呈高度耐藥，根據(jù)分枝桿菌藥敏結果選擇治療方案，對指導臨床治療具有重大意義。傳統(tǒng)藥敏試

3、驗（絕對濃度法和比例法）操作繁雜、費時較長且穩(wěn)定性差，很難滿足臨床需要。而2003年美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）制定的《分枝桿菌藥敏試驗通過標準》（CLSI M24-A）采用標準化的液基微量稀釋法進行藥敏試驗，具有操作相對簡便、不需要特殊設備、準確性高及重復性好的特點，可以篩選有效的新型抗菌藥物。
　　 海魚分枝桿菌是一種見光產(chǎn)色的慢生型分枝桿菌，存在于淡水或咸水中，可導致多種魚類患病。人類在接觸了養(yǎng)魚池、在污染的水中

4、捕魚或游泳時易被感染，因此常被描述為游泳池肉芽腫或養(yǎng)魚池肉芽腫。雖然海魚分枝桿菌感染常有文獻報道，但是關于對其爆發(fā)感染的研究甚少。
　　 本研究：①根據(jù)CLSI M24-A標準，在我們實驗室建立起針對結核分枝桿菌、慢生型NTM和快生型NTM的液基微量稀釋法，與國際標準水平接軌；并進一步采用該方法對我所近年來皮膚標本中分離出的結核菌和NTM臨床株進行藥敏分析；同時評價常見分枝桿菌對氨苯砜和氯法齊明的體外實驗敏感性。②建立起檢測結核

5、分枝桿菌的LAMP方法，初步探討其在皮膚結核組織標本中的應用價值。③對江蘇海安某漁廠進行調查研究海魚分枝桿菌皮膚感染的小爆發(fā)狀況，并給予感染患者含克拉霉素的治療方案，觀察其臨床療效。
　　 本研究論文全文分為三章：
　　 第一章液基微量稀釋法體外測定常見分枝桿菌的藥物敏感性
　　 目的評價結核和非結核分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性。方法根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會推薦的M24-A液基微量稀釋法，測定臨床結核和非結核分

6、枝桿菌對異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、鏈霉素（SM）、左氧氟沙星（LOFX）、阿米卡星（AMK）、多西環(huán)素（DCC）、克拉霉素（CTM）、磺胺甲基異噁唑（SMZ）、氨苯砜（DDS）和氯法齊明（CLO）等藥物的敏感性，其中結核分枝桿菌的結果與傳統(tǒng)絕對濃度法進行比較。同時測定常見分枝桿菌標準株對氨苯砜和氯法齊明的體外敏感性。
　　 結果：8株臨床結核分枝桿菌中，除1株菌對SM耐藥外，各株菌對INH、RFP、

7、EMB、SM、LOFX五種藥物均敏感。3株源于臨床的海魚分枝桿菌中，除1株菌對DCC耐藥外，各株菌對RFP、AMK、DCC、CTM、SMZ五種藥物均敏感。1株臨床性胞內分枝桿菌對CTM敏感。3株臨床性瘰癘分枝桿菌都對DCC耐藥，其中除1株菌同時對RFP和EMB耐藥外，各株菌對INH、RFP、EMB、SM、AMK、CTM、SMZ七種藥物均敏感。3株臨床性膿腫分枝桿菌中，除了1株菌同時對CTM和CLO敏感外，各株菌對LOFX、AMK、DCC

8、、CTM、SMZ、DDS、CLO七種藥物均表現(xiàn)為中間耐藥或耐藥。常見分枝桿菌標準株均對DDS耐藥，結核、海魚和堪薩斯分枝桿菌標準株對CLO敏感。結論不同分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性存在差異?？梢詤⒖俭w外藥敏結果指導臨床用藥選擇。氯法齊明是一種治療結核、海魚和堪薩斯分枝桿菌感染有潛力的藥物。
　　 第二章環(huán)介導等溫擴增技術檢測結核分枝桿菌方法的建立與初步應用
　　 目的建立環(huán)介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌的方法。方法針對結核分

9、枝桿菌復合群gyrB基因序列設計三對特征性引物，采用環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）對結核分枝桿菌進行65℃等溫擴增，1h后分析結果。確定該方法的敏感性和特異性，并初步探討其在皮膚結核組織標本中的應用。結果采用LAMP方法檢測結核分枝桿菌，敏感度與PCR相當；與其他分枝桿菌無交叉反應，具有良好的特異性。5例培養(yǎng)陽性臨床標本中，LAMP和PCR方法敏感度均為2/5

10、。結論結核分枝桿菌環(huán)介導等溫擴增技術檢測方法，不僅快速、特異、敏感，而且簡便價廉，適于在基層實驗室使用。
　　 第三章江蘇某漁廠海魚分枝桿菌感染爆發(fā)的調查研究
　　 背景海魚分枝桿菌是一種非結核光產(chǎn)色慢生型分枝桿菌，可導致人類皮膚感染。雖然海魚分枝桿菌感染常有文獻報道，但是關于其爆發(fā)感染的研究甚少。2008年11月我們在本院診治了一例來自江蘇海安市某漁廠的海魚分枝桿菌皮膚感染患者，問診得知該患者所在漁廠還有多例可疑類似患

11、者。方法我們前往該漁廠進行現(xiàn)場調查，對疑似病例采集病史、體格檢查，完善相關檢查包括：胸片、常規(guī)組織病理學檢查及特殊染色、PPD試驗、潰瘍分泌物涂片抗酸染色、真菌培養(yǎng)、分枝桿菌培養(yǎng)及分子鑒定。綜合病史、既往治療情況、臨床表現(xiàn)及相關檢查，對患者進行初步或最終診斷。然后給予患者克拉霉素單一治療或聯(lián)合復方磺胺甲基異惡唑治療，并隨訪觀察療效。結果經(jīng)調查發(fā)現(xiàn)，海魚分枝桿菌感染病例18例，男13例，女5例，病程2～55月。66.7％（12/18）的患

12、者有明確的被魚刺傷或咬傷史。所有患者均為肢端皮肽損害，其中2例表現(xiàn)為孢子絲菌病樣分布。受檢的13例患者中，僅7例組織學表現(xiàn)為感染性肉芽腫。分泌物涂片抗酸染色陽性率為4/9。PPD試驗陽性率為10/18。組織塊分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為3/8，培養(yǎng)物經(jīng)鑒定為海魚分枝桿菌。含克拉霉素的治療方案治愈率為72.2％（13/18）。治療過程中有4例出現(xiàn)治療抵抗，均發(fā)生于曾經(jīng)接受過局部皮質激素封閉治療者。而未接受過局部封閉治療的患者，均未出現(xiàn)治療抵抗。結