枯草芽孢桿菌分子分型及其對(duì)海水水質(zhì)凈化效果的研究.pdf

1、枯草芽孢桿菌可將水體中有機(jī)物分解為小分子的有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)，因此，它是水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中最有效的水質(zhì)凈化菌種之一。本文首先建立了枯草芽孢桿菌的PCR快速鑒定方法，然后對(duì)海南島不同地理來源的多種海水水體開展了枯草芽孢桿菌的分離、純化和鑒定以及對(duì)各菌株進(jìn)行了RAPD分型的工作，同時(shí)研究了不同遺傳型菌株的水質(zhì)改良效果，具體結(jié)果如下： 1、以枯草芽孢桿菌的gyrB基因設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，分別為F1、F2。以標(biāo)準(zhǔn)的枯草芽孢桿菌做PCR檢

2、測(cè)，結(jié)果表明，F(xiàn)1和F2能獲得分子量分別為387bp和362bp的目的條帶。利用其它12株非枯草芽孢桿菌進(jìn)行PCR特異性檢測(cè)，結(jié)果表明引物對(duì)F1和F2的特異性較強(qiáng)，從而首次成功建立了枯草芽孢桿菌的PCR快速鑒定方法。 2、本文首次以海南島多個(gè)地理來源的不同水體為菌種分離對(duì)象，結(jié)合傳統(tǒng)的生化鑒定手段，采用選擇性培養(yǎng)基和本文建立的PCR快速檢測(cè)方法共分離、純化和鑒定了45株枯草芽孢桿菌菌株，這些菌株的主要來源地為?？?、文昌、萬寧、陵

3、水、樂東、東方、三亞，分別分離得到17株、1株、19株、3株、1株、4株和1株。 3、利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)46株(包括枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ctccAB90008)枯草芽孢桿菌進(jìn)行了分子分型。為了提高RAPD技術(shù)穩(wěn)定性和可重復(fù)性，本文首先優(yōu)化了模板DNA濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度以及退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等RAPD技術(shù)的主要影響因素，最終建立了適用于枯草芽孢桿菌的最佳RAP

4、D反應(yīng)體系，即在25μl的總體系中，包括10×PCRbuffer2.5μl，Mg2+(25mmol/L)為2μL，dNTPs(2.5mmol/L)為2μL，引物(10μmol/L)為1μL，DNA聚合酶1.0U，DNA模板2.0μL；循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性45s、38℃退火45s、72℃延伸1。5min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。通過對(duì)60條RAPD隨機(jī)引物的篩選，共獲得11條對(duì)該菌擴(kuò)增效果穩(wěn)定、多態(tài)性豐富

5、的隨機(jī)引物，選用上述11條引物對(duì)46個(gè)菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，這46株枯草芽孢桿菌具有豐富的遺傳多樣性，共產(chǎn)生了1802條擴(kuò)增條帶，這些條帶呈100％的多態(tài)性，即這些引物都能單獨(dú)使這46株菌株產(chǎn)生特異性的指紋圖譜，因此，本文為上述枯草芽孢桿菌菌株建立了一種極有效分子鑒定方法。根據(jù)UPGMA方法建立了所有菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，在遺傳距離大約為0.53的位置，可以將46個(gè)菌株分成14個(gè)基因型，分別為A～O型、，其中大

6、多數(shù)的菌株集中在第K型和第L型，且絕大多數(shù)相同地理來源的菌株具有更近的親緣關(guān)系。 4、根據(jù)RAPD技術(shù)的分型結(jié)果，本文從14個(gè)遺傳型中分別隨機(jī)選取1株枯草芽孢桿菌進(jìn)行水質(zhì)改良效果研究，測(cè)定的水質(zhì)因子有水體COD、氨氮和pH，結(jié)果表明，菌株WC07001和菌株WL07003的水質(zhì)改良效果明顯，且菌株WC07001對(duì)氨氮的降解作用最佳，而菌株WL07003則對(duì)COD的降解作用最佳，這表明不同枯草芽孢桿菌菌株可能對(duì)水質(zhì)作用效果不一，因