CXCR4基因修飾骨髓間充質干細胞體外遷移實驗.pdf

1、本文旨在構建一種高表達CXCR4的大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs),考察CxCR4時細胞定向遷移能力的影響。
　　 MSCs常用于心肌梗死后的心肌修復,研究表明損傷的心肌組織高表達SDF-1,而MSCs表面表達CXCR4,依靠配體與受體的親和,使MSCs靶向遷移到梗塞部位,參與組織修復。盡管在體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)部分MSCs膜表面有CXCR4的表達,但表達水平低,并且絕大多數(shù)干細胞不表達CXCR4。所以本實驗擬采用逆轉錄病毒轉導C

2、XCR4基因的方式,增加MSCs表面CXCR4的表達量,來加強細胞的遷移速度和數(shù)量。對提高MSCs治療心肌壞死起到積極的效果。
　　 本文通過密度梯度離心法分離出大鼠的骨髓單核細胞,通過貼壁法建立MSCs的體外培養(yǎng)體系,并對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。免疫染色鑒定CD106、CD29、CD44都表達呈陽性,結果顯示MSCs分離培養(yǎng)成功。
　　 論文運用基因工程學方法構建pMSCV-IRES-CXCR4-GFP和pMSCV-ne

3、or-CXCR4兩種逆轉錄病毒載體。測序表明其所攜帶的CXCR4 cDNA與GeneBank公布的序列一致,定向構建的逆轉錄病毒載體連接方向和開放閱讀框正確,證明載體構建成功。
　　 兩種質粒用磷酸鈣法轉染293T包裝病毒,并用制備好的病毒感染MSCs。通過免疫細胞染色及流式細胞儀(FCM)檢測比較兩種質粒的轉導效率。結果表明pMSCV-neo-CXCR4修飾的MSCs中抗體染色后的CXCR4紅色熒光表達量為19.8％,而pMS

4、CV-IRES-CXCR4-GFP中表達量為44.8％,并進一步通過RT-PCR的方法從mRNA水平檢測到CXCR4基因在MSCs中表達。因此,選取pMSCV-CXCR4-IRES-GFP進行后續(xù)實驗。
　　 運用transwell檢測轉基因MSCs在不同濃度SDF-1誘導下的靶向遷移效率。Transwell實驗結果顯示,CXCR4基因修飾的MSCs,向SDF-1的遷移能力得到顯著增強,濃度在50ng/mL時為最佳遷移濃度,加入