CXCR4基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn).pdf

1、本文旨在構(gòu)建一種高表達(dá)CXCR4的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),考察CxCR4時(shí)細(xì)胞定向遷移能力的影響。
　　 MSCs常用于心肌梗死后的心肌修復(fù),研究表明損傷的心肌組織高表達(dá)SDF-1,而MSCs表面表達(dá)CXCR4,依靠配體與受體的親和,使MSCs靶向遷移到梗塞部位,參與組織修復(fù)。盡管在體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)部分MSCs膜表面有CXCR4的表達(dá),但表達(dá)水平低,并且絕大多數(shù)干細(xì)胞不表達(dá)CXCR4。所以本實(shí)驗(yàn)擬采用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)C

2、XCR4基因的方式,增加MSCs表面CXCR4的表達(dá)量,來加強(qiáng)細(xì)胞的遷移速度和數(shù)量。對(duì)提高M(jìn)SCs治療心肌壞死起到積極的效果。
　　 本文通過密度梯度離心法分離出大鼠的骨髓單核細(xì)胞,通過貼壁法建立MSCs的體外培養(yǎng)體系,并對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。免疫染色鑒定CD106、CD29、CD44都表達(dá)呈陽性,結(jié)果顯示MSCs分離培養(yǎng)成功。
　　 論文運(yùn)用基因工程學(xué)方法構(gòu)建pMSCV-IRES-CXCR4-GFP和pMSCV-ne

3、or-CXCR4兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。測序表明其所攜帶的CXCR4 cDNA與GeneBank公布的序列一致,定向構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體連接方向和開放閱讀框正確,證明載體構(gòu)建成功。
　　 兩種質(zhì)粒用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T包裝病毒,并用制備好的病毒感染MSCs。通過免疫細(xì)胞染色及流式細(xì)胞儀(FCM)檢測比較兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。結(jié)果表明pMSCV-neo-CXCR4修飾的MSCs中抗體染色后的CXCR4紅色熒光表達(dá)量為19.8％,而pMS

4、CV-IRES-CXCR4-GFP中表達(dá)量為44.8％,并進(jìn)一步通過RT-PCR的方法從mRNA水平檢測到CXCR4基因在MSCs中表達(dá)。因此,選取pMSCV-CXCR4-IRES-GFP進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 運(yùn)用transwell檢測轉(zhuǎn)基因MSCs在不同濃度SDF-1誘導(dǎo)下的靶向遷移效率。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CXCR4基因修飾的MSCs,向SDF-1的遷移能力得到顯著增強(qiáng),濃度在50ng/mL時(shí)為最佳遷移濃度,加入