攜帶TRAIL和IL-24的雙基因三靶向溶瘤腺病毒構(gòu)建及抗癌效果初探.pdf

1、浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文浙江理工大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對(duì)所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月Et浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文攜帶刃跪億和盔弘的雙基因三靶向溶瘤腺病

2、毒構(gòu)建及其抗癌效果初探中文摘要溶瘤腺病毒作為治療腫瘤的新興療法之一，近年來(lái)已經(jīng)成為基因治療領(lǐng)域令人矚目的熱點(diǎn)。劉新垣院士提出的“癌癥的靶向基因病毒療法”利用溶瘤腺病毒作為載體攜帶外源性抗癌基因。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用ZD55系統(tǒng)構(gòu)建出各種攜帶不同基因的溶瘤腺病毒，并在細(xì)胞水平和移植瘤動(dòng)物模型中取得了較好的抗癌效果。為了改善靶向基因病毒療法，需要進(jìn)一步提高溶瘤腺病毒的靶向性和腫瘤殺傷作用。我們將腺病毒EIB551(刪除使得腺病毒由于晚期RNA

3、無(wú)法輸出而不能在正常細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，將E1ACR2的24bp序列缺失使之能靶向于Rb突變的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)利用腫瘤特異性啟動(dòng)子survivin啟動(dòng)子控制E1A的表達(dá)；此外，利用Caspase8的特異性酶切位點(diǎn)將促凋亡基因TRAIL和抑癌基因1_[24相連接，由此構(gòu)建出雙基因三靶向的溶瘤腺病毒。我們通過改進(jìn)的AdEasy系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了腺病毒的重組，并且在HEK293細(xì)胞中包裝出有活性的病毒顆粒。經(jīng)過小量擴(kuò)增、大量擴(kuò)增和純化后的病毒對(duì)20余株

4、腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了初步篩選，發(fā)現(xiàn)這些腫瘤細(xì)胞株對(duì)于Adsp系列病毒的敏感性不一，其中尤以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251最為敏感。然而，結(jié)晶紫染色的結(jié)果表明U251細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性主要源于病毒復(fù)制而不是抗癌基因。于是，我們繼續(xù)利用MTT法檢測(cè)Adsp系列病毒對(duì)于包括肝癌細(xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系、胃癌細(xì)胞系、前列腺癌細(xì)胞系在內(nèi)的多種細(xì)胞系的抑制作用。結(jié)果表明，攜帶雙基因的AdspE1A△24)E1B(△ss)TRAILIETDIL24AE3在多種腫瘤細(xì)胞系

5、中殺傷作用優(yōu)于只攜帶單基因的溶瘤腺病毒。Hoechst33342和PI雙染色結(jié)果也證明，HuH7細(xì)胞在感染后發(fā)生細(xì)胞凋亡。同時(shí)，在相同感染復(fù)數(shù)的條件下Adsp系列病毒對(duì)正常細(xì)胞MRC5和QSG7701的毒性很小。在裸鼠皮下注射HuH7細(xì)胞的肝癌移植瘤模型中，AdspE1A(△24)E1B(△ss)TRAILIETDIL24／XE3對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用優(yōu)于只攜帶TRAIL或億彩的Ad—sp病毒。綜上，我們成功構(gòu)建了雙基因三調(diào)控溶瘤腺病毒