引入反向重復(fù)序列的腺病毒在肝癌介導(dǎo)選擇性表達(dá)和溶瘤.pdf

1、博士學(xué)位論文中文摘要摘要腺病毒載體目前廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)。近年來發(fā)展了一些新的載體構(gòu)建策略使其效應(yīng)獲得腫瘤選擇性，引入反向重復(fù)序列便是其中之一。El基因刪除的腺病毒載體能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制病毒DNA，在其目的基因兩側(cè)插入反向重復(fù)序列，當(dāng)病毒DNA在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制時介導(dǎo)同源重組，激活目的基因，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的腫瘤選擇性。我們研究了根據(jù)這個策略構(gòu)建的載體Ad.lRBG在原發(fā)性肝癌和結(jié)腸轉(zhuǎn)移性肝癌實(shí)驗(yàn)性治療中的效果

2、。我們首先證實(shí)Ad.lRBG在體外能選擇性地在肝細(xì)胞癌(SMMC7721MHCC97)和結(jié)腸癌(LoVoHT29)細(xì)胞中表達(dá)報告基因(agal)，而在正常肝細(xì)胞(WB)中的表達(dá)水平極低。不含反向重復(fù)序列的腺病毒載體Ad.BG表達(dá)pgal沒有選擇性。通過尾靜脈注射，Ad.lRBG能選擇性地在SMMC7721和LoVo裸鼠肝臟移植瘤內(nèi)表達(dá)卜gal，腫瘤和瘤周肝表達(dá)比顯著高于Ad.BG。使用DNA合成抑制劑羚基脈能抑制Ad.lRBG感染的腫瘤

3、細(xì)胞內(nèi)病毒DNA的重組及卜gal的表達(dá)，而不影響Ad.BG的表達(dá)。這些結(jié)果說明Ad.lRBG表達(dá)目的基因依賴病毒DNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和重組，非腫瘤細(xì)胞被其感染后無此過程，目的基因因此不表達(dá)，是選擇性表達(dá)的機(jī)制。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Ad.IRBG還能選擇性在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生溶瘤效應(yīng)(Oncolysis)aAd.lRBG感染的SMMC7721和LoVo細(xì)胞發(fā)生明顯的生長抑制和病理形態(tài)變化，利用“再感染”試驗(yàn)和實(shí)時PCR，在其培養(yǎng)液中能檢測到具有

4、感染性的病毒顆粒且數(shù)量呈指數(shù)增長，提示是病毒大量復(fù)制引起溶瘤。Ad.lRBG局部注射能抑制SNMC7721和LoVo肝臟移植瘤的生長，顯示直接的腫瘤殺傷作用，而Ad.BG無此作用。盡管Ad.lRBG感染的WB細(xì)胞內(nèi)也存在病毒DNA復(fù)制，卻檢測不到病毒顆粒，Western印跡在Ad.lRBG感染的SMMC7721和LoVo細(xì)胞中能檢測到病毒衣殼蛋白，WB細(xì)胞則無。說明腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對病毒衣殼蛋白合成的激活存在差別，可能是Ad.IRBG

5、在腫瘤細(xì)胞中選擇性地復(fù)制的原因之一。引入反向重復(fù)序列的腺病毒載體AdJRBG除選擇性地在肝癌中表達(dá)目的基因外，還能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制引起溶瘤效應(yīng)而產(chǎn)生直接殺傷作用，這是本研究的新發(fā)現(xiàn)。這種聯(lián)合基因轉(zhuǎn)移和溶瘤效應(yīng)并具有腫瘤選擇性的腺病毒載體可成為肝癌基因治療的新方向。關(guān)鍵詞:肝癌，基因治療，腺病毒載體，治療靶向性博士學(xué)位論文中文詳細(xì)摘要中文詳細(xì)摘要肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等病理機(jī)制在分子和基因水平得到認(rèn)識和闡明，使基因治療成為最具前景的治

6、療方式。各種不同策略的肝癌基因治療方案正在基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)兩個層面展開，腺病毒載體由于其諸多優(yōu)點(diǎn)而成為肝癌基因治療最常用的載體。獲得腫瘤選擇性的治療效應(yīng)是腫瘤治療的一個重要原則。腺病毒載體用于肝癌治療的腫瘤選擇性問題有其特殊性。腺病毒載體能高效率地感染肝臟內(nèi)正常肝細(xì)胞，而肝癌細(xì)胞由于惡性表型丟失細(xì)胞表面CAR表達(dá)，攝取載體效率低。這使腺病毒載體難以在肝癌細(xì)胞中獲得高效率的治療效應(yīng)。設(shè)計和使用具有腫瘤選擇性的腺病毒載體成為有效治療的關(guān)鍵

7、。目前使用腫瘤特異性的啟動子如AFP和CEA分別在原發(fā)性和結(jié)腸轉(zhuǎn)移性肝癌組織中獲得選擇性的表達(dá)或溶瘤，但表達(dá)效率，選擇性仍差。在腺病毒基因組中引入反向重復(fù)序列是獲得腺病毒載體腫瘤選擇性的新策略，被初步證明是有效的。本課題研究了引入反向重復(fù)序列的腺病毒載體在原發(fā)性和結(jié)腸轉(zhuǎn)移性肝癌中能否獲得腫瘤選擇性的治療效應(yīng)，并探討相關(guān)機(jī)制。第一部分載體的設(shè)計思路，構(gòu)建、擴(kuò)增及鑒定引入反向重復(fù)序列使腺病毒載體產(chǎn)生腫瘤選擇性的基因表達(dá)，這個設(shè)計基于兩個發(fā)現(xiàn)

8、。一是EIA刪除的腺病毒載體(Ad.El一)能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制其DNA.二是在腺病毒基因組中加入反向重復(fù)序列，病毒DNA在被感染細(xì)胞中可發(fā)生同源重組，產(chǎn)生新的雙鏈DNA形式。美國華盛頓大學(xué)的一個研究小組利用這兩個發(fā)現(xiàn)設(shè)計了新載體。以Ad.E1載體作為基本骨架，將目的基因反向置于啟動子下游并在其兩側(cè)插入反向重復(fù)序列，當(dāng)其在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制DNA時發(fā)生重組，產(chǎn)生的新的病毒DNA形式中目的基因被恢復(fù)為與啟動子同向而被表達(dá)。Ad.E1載體能在腫瘤