豬源BVDV-2非結(jié)構(gòu)蛋白Npro的原核表達(dá)及其對(duì)豬PBMCs和相關(guān)細(xì)胞因子的影響.pdf

1、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）是牛病毒性腹瀉(牛病毒性腹瀉-黏膜病，BVD-MD)的病原體，為正鏈RNA病毒，全基因組長約12.3 kb，歸類于黃病毒科瘟病毒屬。根據(jù)BVDV基因組分析的遺傳特征，其可分為基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)。先前的流行病學(xué)調(diào)查顯示BVDV-1的流行區(qū)域更為廣泛，然而，近年來國內(nèi)BVDV-2的發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢(shì)。BVDV的宿主譜廣，除了

2、可以引起牛的病毒性腹瀉以外，豬、山羊、綿羊、鹿和野生反芻動(dòng)物等其他動(dòng)物也可感染，值得警惕的是，近年來豬感染BVDV的情況日趨增多。研究報(bào)道，BVDV的非結(jié)構(gòu)蛋白Npro在抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可以協(xié)助病毒逃逸宿主的先天免疫反應(yīng)?；诜墙Y(jié)構(gòu)蛋白Npro在BVDV病原學(xué)上的重要功能和致病性，在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中，對(duì)豬源BVDV-2病原性作了相關(guān)探索，在細(xì)胞水平上初步探析了豬源BVDV-2非結(jié)構(gòu)蛋白Npro的功能，為深入研究該蛋白對(duì)動(dòng)物

3、機(jī)體免疫功能的影響及其致病性的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究旨在探究豬源BVDV-2非結(jié)構(gòu)蛋白Npro對(duì)于豬免疫功能的影響，初步了解其在BVDV感染豬體的分子機(jī)制發(fā)揮的作用，為豬源BVDV的預(yù)警和防控提供一定理論基礎(chǔ)。
　　本研究主要分以下3個(gè)部分:
　　研究一:豬源BVDV-2非結(jié)構(gòu)蛋白Npro的原核表達(dá)。為了保證后續(xù)仔豬攻毒實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，我們誘導(dǎo)表達(dá)了豬源BVDV-2分離株SH-28的非結(jié)構(gòu)蛋白Npro并制各其多抗血清。將

4、豬源BVDV-2分離株SH-28在MDBK細(xì)胞上增殖培養(yǎng)，再從細(xì)胞中提取總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增Npro基因片段，并將其克隆至pMD19-Tsimple vector，從而獲得重組質(zhì)粒pMD19-T-Npro。然后，將目的片段插入pET-28a(+)中，構(gòu)建了以E.coli BL21(DE3)為宿主菌的原核表達(dá)系統(tǒng)。SDS-PAGE電泳證實(shí)了約26 KDa的包涵體重組蛋白Npro成功表達(dá)。BCA法測(cè)定純

5、化的重組蛋白其濃度為1.23 mg/mL。然后通過用純化的Npro重組蛋白三次免疫小鼠，來制備多克隆抗體血清，間接ELISA方法測(cè)定其滴度為1∶12800。Western biot證實(shí)Npro多抗血清能與純化的Npro重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。說明我們成功制備了Npro蛋白的多抗血清，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　研究二:豬源BVDV-2非結(jié)構(gòu)蛋白Npro對(duì)豬外周血細(xì)胞的影響。為探究豬源BVDV-2非結(jié)構(gòu)蛋白Npro對(duì)豬外周血免疫細(xì)胞的影響

6、，本實(shí)驗(yàn)用4 mL(107 TCID50/0.1 mL)豬源BVDV-2分離株SH-28及4mL(107 TCID50/0.1 mL)缺失株vASH△Npro分別感染無BVDV和豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)病原的30日齡斷奶仔豬，對(duì)照組肌注4mL DMEM培養(yǎng)基。采集感染組豬的血液，進(jìn)行病毒分離鑒定，驗(yàn)證豬源BVDV-2是否成功感染豬。結(jié)果顯示，從兩組感染豬體內(nèi)分離到的病毒SH-28/p和

7、vASH△Npro/p均能與針對(duì)BVDV E2蛋白的單克隆抗體Bz-53發(fā)生特異性反應(yīng);但Npro的多克隆抗體只能識(shí)別SH-28/p，而vASH△Nprop不能和Npro多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，證實(shí)豬源BVDV-2分離株及其缺失株均感染豬成功，并能從豬體分離到病毒。每天觀察、記錄實(shí)驗(yàn)豬只的臨床表征并打分、體溫變化，結(jié)果顯示:SH-28感染組豬的臨床表征分值在第1～14 day post-infection(dpi)呈逐漸升高的趨勢(shì)，之

8、后開始下降。而缺失株感染組在攻毒后10天內(nèi)臨床表征不明顯，到第16 dpi時(shí)臨床表征分值達(dá)到最高，之后開始好轉(zhuǎn);感染后期，兩個(gè)感染組的臨床分值均顯著高于對(duì)照組差異顯著（P＜0.01）。分離株SH-28感染組豬的體溫從第3～10 dpi呈逐漸上升趨勢(shì)，第10 dpi體溫最高，且達(dá)到41.5℃左右;而缺失株感染組在攻毒后8天內(nèi)體溫變化不明顯，到第12 dpi時(shí)體溫達(dá)到最高，約40.5℃;在感染中期，兩個(gè)感染組均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01

9、）。兩個(gè)感染組豬體溫在感染后期均恢復(fù)正常。
　　進(jìn)一步采用血液常規(guī)術(shù)檢測(cè)感染后實(shí)驗(yàn)豬外周血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板的變化，結(jié)果表明:三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的豬外周血中白細(xì)胞數(shù)量均在6 dpi后開始出現(xiàn)大幅度波動(dòng)，在第18 dpi、20 dpi分離株SH-28感染組極顯著低于缺失株vASH△Npro感染(P＜0.01）;三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的紅細(xì)胞數(shù)量在整個(gè)感染周期中均無顯著差異;在感染的前、中期，血小板數(shù)量變化的波動(dòng)幅度很大，從第12 dpi開始出現(xiàn)分

10、離株SH-28感染組極顯著低于缺失株vASH△Npro感染組(P＜0.01)。CD4T和CD8T細(xì)胞是免疫反應(yīng)中的兩個(gè)重要指標(biāo)，進(jìn)而利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)這兩個(gè)T淋巴細(xì)胞亞群的變化，結(jié)果顯示:在感染的中、后期，缺失株vASH△Npro感染組豬PBMCs中CD4T細(xì)胞的比例顯著高于其他兩組（P＜0.05）;缺失株vASH△Npro感染組豬PB

11、MCs中CD8T細(xì)胞的比例極顯著高于其他兩組（P＜0.01）。
　　綜上，本試驗(yàn)說明了感染豬源BVDV-2可引起豬體內(nèi)白細(xì)胞和血小板的下降，而Npro蛋白的缺失可使白細(xì)胞數(shù)量回升，初步證實(shí)了Npro蛋白的缺失可減弱豬源BVDV-2的致病性。此外，Npro蛋白的缺失還可引起CD8T細(xì)胞和CD4T細(xì)胞的比例上升，提高了豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)。這為豬源BVDV-2的致病機(jī)理及其免疫機(jī)制的探究提供了重要線索。
　　研究三:豬源BVDV-2

12、非結(jié)構(gòu)蛋白Npro對(duì)豬PBMCs產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響。為了探究豬源BVDV-2非結(jié)構(gòu)蛋白Npro對(duì)細(xì)胞因子介導(dǎo)的抗病毒免疫機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測(cè)SH-28和缺失株vASH△Npro感染豬PBMCs中7種細(xì)胞因子(IL-1β、IL-8、IL-10、1FN-α、OAS、Mxl、PKR) mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，從而闡明Npro蛋白對(duì)宿主抗病毒免疫的調(diào)節(jié)機(jī)制

13、，進(jìn)一步揭示其在豬源BVDV-2感染豬體過程中所發(fā)揮的作用。IL-1β和IL-8的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示:兩個(gè)感染組的轉(zhuǎn)錄水平都有先上升后降低的趨勢(shì)，并在感染中期，出現(xiàn)分離株SH-28感染組極顯著高于其他兩組(P＜0.01）。IL-10的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示:雖然，兩個(gè)感染組豬體內(nèi)的IL-10均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但在感染前期、中期，出現(xiàn)缺失株vASH△Npro感染組極顯著高于其他兩組的情況（P＜0.01）。進(jìn)一步檢測(cè)豬體內(nèi)干擾素及其下游抗病毒因子的表

14、達(dá)，發(fā)現(xiàn)豬感染BVDV后，兩個(gè)感染組豬體內(nèi)IFN-α、OAS和Mxl的表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，但其表達(dá)量仍高于對(duì)照組(P＜0.05)，尤其是OAS，且缺失株感染組顯著高于SH-28感染組(P＜0.01）。此外，雖然SH-28感染組和缺失株感染組PKR的表達(dá)量在感染的前、中期均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，但兩者之間并沒有呈現(xiàn)較為規(guī)律的差異性。
　　綜上，本試驗(yàn)證實(shí)了豬源BVDV-2非結(jié)構(gòu)蛋白Npro對(duì)豬PBMCs中細(xì)胞因子有一定影響