豬源PTX3蛋白的真核表達(dá)及其對(duì)豬鏈球菌2型的抗菌作用研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是一種重要的人畜共患病病原菌。目前對(duì)于該病的治療主要采用抗生素療法，但長(zhǎng)期大量使用抗生素必然存在抗生素耐藥性的風(fēng)險(xiǎn);另外針對(duì)該病，臨床上仍缺乏有效預(yù)防豬鏈球菌的疫苗，故尋求能替代的治療方案以及抗微生物化合物是備受關(guān)注的。
　　PTX3是第一個(gè)被確認(rèn)的長(zhǎng)正五聚蛋白，具有結(jié)合到某些病原微生物的能力，PTX3也可以促進(jìn)細(xì)胞吞噬功能以及隨后病原體的清除。另外，PTX3具有充當(dāng)調(diào)理素的治

2、療效果，可識(shí)別微生物成分，引發(fā)炎癥反應(yīng)的放大。
　　本試驗(yàn)首先通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-32a-ptx3，獲得原核表達(dá)豬源PTX3蛋白，并制備兔抗原核表達(dá)PTX3蛋白血清;隨后又構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pIRES-EGFP-ptx，并轉(zhuǎn)染至真核表達(dá)宿主CHO細(xì)胞中，通過(guò)G418(750μg/ml)篩選獲得能夠穩(wěn)定、大量表達(dá)PTX3蛋白的單克隆細(xì)胞株，并采用Ni-NTA親和層析方法純化細(xì)胞培養(yǎng)上清獲得純度較高、性質(zhì)穩(wěn)定的真核表達(dá)豬源P

3、TX3蛋白;隨后成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pVAX-ptx3，將純化的重組質(zhì)粒肌肉注射BALB/c小鼠(100μg/只），在接種后第1，3，5，7，15，20天取外周血及注射部位肌肉，分別用RT-PCR和Western-blot方法進(jìn)行檢測(cè)，在第15天左右均可檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物，表明該重組質(zhì)粒可在小鼠組織內(nèi)進(jìn)行有效表達(dá)。
　　通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)的豬源PTX3介導(dǎo)一系列抗菌反應(yīng)，包括提高豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21)對(duì)豬鏈球菌2型的吞噬能

4、力以及抑制豬鏈球菌2型對(duì)Hep-2細(xì)胞的粘附。在小鼠模型中，用pVAX-ptx3預(yù)先接種的小鼠的死亡率降低，并且血、脾、肺、腦中的豬鏈球菌的載量顯著降低;在仔豬模型中，預(yù)先接種pVAX-ptx3的仔豬感染豬鏈球菌2型后，外周血中的細(xì)菌載量顯著降低，而IL-6和IL-8的血漿水平則顯著升高，與此相反，接種組仔豬外周血中的白細(xì)胞(WBC)和中性粒細(xì)胞(NEU)則相對(duì)降低。以上結(jié)果表明豬源PTX3以及pVAX-ptx3表達(dá)的PTX3蛋白對(duì)豬鏈