雪旺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及甲基強(qiáng)地松龍對(duì)雪旺細(xì)胞分泌功能影響的研究.pdf

1、神經(jīng)再生室技術(shù)的出現(xiàn)，解決了短距離神經(jīng)再生的問題。但是除自體神經(jīng)移植外，其他人工修復(fù)技術(shù)尚無(wú)法解決長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損的問題。盡管組織工程技術(shù)在不斷發(fā)展，但體外構(gòu)建的“人工神經(jīng)”還沒有從本質(zhì)上超越再生室技術(shù)。其原因是組織工程中作為種子細(xì)胞的細(xì)胞老化、分泌能力下降等諸多問題。雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，也是最重要的種子細(xì)胞。雪旺細(xì)胞分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其分泌能力受諸多因素影響，甲基強(qiáng)地松龍(MP)被認(rèn)為是一種

2、通過抑制脂質(zhì)過氧化而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞及其突起發(fā)揮保護(hù)作用的藥物。 目的： 1．采用新生SD大鼠的雪旺細(xì)胞作為周圍神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞，在體外分離培養(yǎng)，探索體外培養(yǎng)及增殖雪旺細(xì)胞的方法。 2．選取生長(zhǎng)狀況和純度較好的第二代細(xì)胞，將經(jīng)胰酶消化下來的細(xì)胞接種到六孔板中，以不同濃度的MP作用于雪旺細(xì)胞，以研究MP對(duì)雪旺細(xì)胞分泌功能影響。 方法： 1．取SD大鼠的新生鼠雙側(cè)的坐骨、臂叢神經(jīng)，剪碎至1mm3大小的

3、組織塊，雙酶消化法進(jìn)行分離培養(yǎng)，阿糖胞苷抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，低濃度胰酶快速消化傳代進(jìn)一步純化雪旺細(xì)胞，用光鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、S-100蛋白進(jìn)行鑒定。 2．取生長(zhǎng)狀況較好的第二代細(xì)胞，將經(jīng)胰酶消化下來的細(xì)胞接種到六孔板中，以不同濃度的MP(10-3、10-4、10-6、10-8mol/L)作用于雪旺細(xì)胞，作用24、48和72h，設(shè)立不加藥物的空白對(duì)照組，并通過RT-PCR的方法半定量檢測(cè)其分泌的NGF，以研究MP對(duì)雪旺細(xì)胞分泌功能

4、的影響。 結(jié)果： 1．通過上述方法分離培養(yǎng)獲得了經(jīng)S-100蛋白鑒定純度為88％的第二代雪旺細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量為3.128×107/ml，細(xì)胞形態(tài)多數(shù)為梭形，細(xì)胞排列成典型的漩渦狀或柵欄狀。 2. RT-PCR方法檢測(cè)后，經(jīng)Lab works 4.60軟件進(jìn)行分析處理，以內(nèi)參基因B-actin為基準(zhǔn)分析各條帶的相對(duì)密度值，應(yīng)用Spass 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)論：10-8mol/L的MP作用72h分泌的NGF

5、與空白對(duì)照組比較及與其它濃度、時(shí)間組比較表達(dá)增加(p<0.05)；10-3 mol/L的MP在各時(shí)間段分泌的NGF與空白對(duì)照組及其它濃度、時(shí)間組比較表達(dá)減少(P<0.05)。 結(jié)論： 1．新生SD大鼠坐骨、臂叢神經(jīng)中分離培養(yǎng)雪旺細(xì)胞來源確實(shí)，取材方便，可以作為周圍神經(jīng)組織工程試驗(yàn)研究的種子細(xì)胞來源，采用雙酶消化法、阿糖胞苷抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，可以獲得較高純度的雪旺細(xì)胞。 2．不同濃度的MP對(duì)雪旺細(xì)胞的分泌能力有不