水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以廣西水牛睪丸作為研究材料。通過分析比較多個(gè)不同物種睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法,首次體外成功培養(yǎng)出水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行冷凍保存等相關(guān)研究,然后通過質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出該細(xì)胞內(nèi)總蛋白的種類,本研究主要分為四個(gè)試驗(yàn)。
　　試驗(yàn)一:初步建立水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。通過綜合參考不同物種睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法,對(duì)培養(yǎng)皿的選擇、膠原酶的消化時(shí)間長(zhǎng)短、Percoll的使用方法等一一對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn),選擇CORNING公司的培養(yǎng)皿

2、,膠原酶IV消化30-40 min,Percoll配置成1.090、1.080、1.065、1.045四個(gè)梯度,并在培養(yǎng)6h之后更換細(xì)胞培養(yǎng)液,能夠得到最大純度的水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞。
　　試驗(yàn)二:對(duì)試驗(yàn)一中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行凍融操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn):①生長(zhǎng)天數(shù)小于3d時(shí),用0.25％胰蛋白酶與4倍體積的PBS相結(jié)合,需要消化3min左右。生長(zhǎng)天數(shù)大于7d時(shí),消化時(shí)間需延長(zhǎng)至30-40 min。②與原代培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞相比

3、,傳代之后,細(xì)胞的生殖及增殖能力明顯下降。③間質(zhì)細(xì)胞冷凍保護(hù)劑配方為:70%DMEM/F12培養(yǎng)液(無血清)+20%FBS(胎牛血清)+10%DMSO。
　　試驗(yàn)三:分別用0 IU、25 IU、50 IU、100 IU的人絨毛膜促性腺激素(HCG)對(duì)試驗(yàn)一中得到的原代間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行刺激試驗(yàn)(0 IU為對(duì)照組)。并用牛睪酮試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中雄激素睪酮的水平,結(jié)果表明,不同濃度的HCG,間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的雄激素水平不同,且當(dāng)HCG濃度為

4、50 IU時(shí),睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生雄激素的量最大。
　　試驗(yàn)四:運(yùn)用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),初步鑒定水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞,我們得到了3062個(gè)蛋白質(zhì)。在代謝通路方面,有很多代謝通路和睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生理功能有關(guān),其中甾族化合物代謝通路就是睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成雄性激素的途徑,在所得到的蛋白質(zhì)中,我們鑒定到有4種蛋白質(zhì)參與甾類體化合物的合成途徑:P450 cytochrome P450、lanosterol synthase、sterol o-ac