水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、本實驗以廣西水牛睪丸作為研究材料。通過分析比較多個不同物種睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法,首次體外成功培養(yǎng)出水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞,并對其進(jìn)行冷凍保存等相關(guān)研究,然后通過質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出該細(xì)胞內(nèi)總蛋白的種類,本研究主要分為四個試驗。
　　試驗一:初步建立水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。通過綜合參考不同物種睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法,對培養(yǎng)皿的選擇、膠原酶的消化時間長短、Percoll的使用方法等一一對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn),選擇CORNING公司的培養(yǎng)皿

2、,膠原酶IV消化30-40 min,Percoll配置成1.090、1.080、1.065、1.045四個梯度,并在培養(yǎng)6h之后更換細(xì)胞培養(yǎng)液,能夠得到最大純度的水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞。
　　試驗二:對試驗一中生長狀態(tài)良好的水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行凍融操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn):①生長天數(shù)小于3d時,用0.25％胰蛋白酶與4倍體積的PBS相結(jié)合,需要消化3min左右。生長天數(shù)大于7d時,消化時間需延長至30-40 min。②與原代培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞相比

3、,傳代之后,細(xì)胞的生殖及增殖能力明顯下降。③間質(zhì)細(xì)胞冷凍保護(hù)劑配方為:70%DMEM/F12培養(yǎng)液(無血清)+20%FBS(胎牛血清)+10%DMSO。
　　試驗三:分別用0 IU、25 IU、50 IU、100 IU的人絨毛膜促性腺激素(HCG)對試驗一中得到的原代間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行刺激試驗(0 IU為對照組)。并用牛睪酮試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中雄激素睪酮的水平,結(jié)果表明,不同濃度的HCG,間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的雄激素水平不同,且當(dāng)HCG濃度為

4、50 IU時,睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生雄激素的量最大。
　　試驗四:運用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),初步鑒定水牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞,我們得到了3062個蛋白質(zhì)。在代謝通路方面,有很多代謝通路和睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生理功能有關(guān),其中甾族化合物代謝通路就是睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成雄性激素的途徑,在所得到的蛋白質(zhì)中,我們鑒定到有4種蛋白質(zhì)參與甾類體化合物的合成途徑:P450 cytochrome P450、lanosterol synthase、sterol o-ac