紡錘體檢查點蛋白BubR1和Cenp-E與肝癌細胞染色體數(shù)目異常的關(guān)系.pdf

1、目的： 研究紡錘體檢查點(spindle checkpoint,SCP)蛋白BubR1和Cenp-E在癌組織和正常肝組織表達差異，利用間接免疫熒光技術(shù)與RNAi技術(shù)在肝癌細胞系(HepG-2)和正常肝細胞系(LO2)中進一步研究SCP基因BubRl和Cenp-E在肝癌細胞中的定位和作用。為進一步闡明肝癌細胞染色體數(shù)目異常的機理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.用FQ-PCR和Western-blot，間接免疫熒光來檢測SC

2、P基因BubRl和Cenp-E在肝癌組織和正常肝組織基因和蛋白的表達情況。 2.用染色體分析技術(shù)分析人類肝癌細胞系(HepG-2)和人類正常肝細胞系(LO2)染色體數(shù)目異常情況。 3.用Nocodazole(諾考達唑)同時處理HepG-2細胞和LO2細胞使兩種細胞高度同步在分裂期，流式細胞儀測定處理前后的HepG-2細胞和LO2細胞同步在分裂期情況。 4.利用FQ-PCR和Western-blot檢測BubR1和

3、Cenp-E基因在兩種同步化的細胞mRNA和蛋白的表達水平。 5.間接免疫熒光技術(shù)觀察Cenp-E蛋白在兩種細胞中的定位及表達。 6.在LO2細胞中用RNAi技術(shù)干擾Cenp-E基因后，用FQ-PCR和Western-blot檢測BubR1和Cenp-E基因在干擾前后mRNA和蛋白的表達水平。并利用MTT，間接免疫熒光進一步評價干擾后的細胞功能情況。 結(jié)果： 1.FQ-PCR和Western-blot，間接免疫熒

4、光檢測BubR1、Cenp-E基因在肝癌組織和正常肝組織表達，發(fā)現(xiàn)BubR1和Cenp-E在正常肝組織的表達明顯高于肝癌組織，差異有統(tǒng)計學意義。 2.染色體分析發(fā)現(xiàn)HepG-2細胞染色體數(shù)目異常程度明顯高于LO2細胞，差異具有統(tǒng)計學意義。 3.用流式細胞儀檢測用Nocodazole處理前后的HepG-2細胞和LO2細胞發(fā)現(xiàn)處理前兩種細胞G2-M期的比例差異不顯著。處理后兩種細胞的G2-M期細胞都大幅增加，但兩組細胞中期細

5、胞比例差異不顯著。 4.FQ-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，Nocodazole處理前BubR1和C-E基因和蛋白在LO2和HepG-2細胞中表達無顯著差異，處理后BubR1和Cenp-E基因和蛋白在兩種細胞表達都增高，但LO2細胞上調(diào)水平大于HepG-2細胞，差異具有統(tǒng)計學意義。 5.間接免疫熒光結(jié)果顯示Cenp-E蛋白主要定位細胞核內(nèi)，并且在出現(xiàn)異常分裂的細胞核內(nèi)Cenp-E蛋白的表達明顯低于正常分裂的細