天仙子氮甲基腐胺轉(zhuǎn)移酶(PMT)基因啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、茄科植物天仙子（Hyoscyamus niger L.）,是一類能夠產(chǎn)生托品烷生物堿（tropane alkaloids，TAs）的重要藥用植物，其中莨菪堿、東莨菪堿是被廣泛使用的抗膽堿制劑。近年來，代謝工程的興起使得遺傳改造TAs生物合成途徑成為可能，而代謝工程依賴于對該途徑的分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究。高等植物功能基因的轉(zhuǎn)錄翻譯特點與其調(diào)控機制一直是植物基因工程領(lǐng)域比較熱門的研究方向。對植物啟動子的研究有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及

2、其調(diào)控機制，并應(yīng)用于基因工程中提高或改進外源目的基因的表達(dá)。啟動子按其轉(zhuǎn)錄方式的不同可以分為組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組成型啟動子驅(qū)動外源基因的組成型表達(dá)往往會造成資源的浪費，同時異源蛋白的過量積累也會造成植物代謝紊亂，不能正常生長。因此研究組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子更具有價值。
　　茉莉酸（jasmonie acid,JA）及其甲酯（methyl jasmonate,MeJA）是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，JA、

3、MeJA及其他JA衍生物統(tǒng)稱為茉莉酸類（jasmonates，JAs）。這些信號分子影響各種植物過程,包括傷害,非生物脅迫,防御昆蟲和寄生的病原體。此外JAs還能夠在轉(zhuǎn)錄水平上影響植物次生代謝。
　　MeJ A作為誘導(dǎo)子影響次生代謝物合成的研究越來越受到人們的關(guān)注。就目前為止，國內(nèi)外已有大量的關(guān)于 JAs誘導(dǎo)產(chǎn)生植物次生代謝物的報道，這些研究多數(shù)是結(jié)合基因工程、功能基因組等分子生物學(xué)技術(shù)進行研究。本研究以天仙子為試驗材料，研究氮甲

4、基腐胺轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子，旨在闡明啟動子不同區(qū)域發(fā)揮的功能，及其初步探索啟動子對MeJ A的響應(yīng)情況。利用high-efficiency TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)方法克隆了HnPMT基因的啟動子，將啟動子及用PCR方法獲得的一系列5＇端缺失片段與報告基因GUS融合，轉(zhuǎn)化擬南芥和天仙子發(fā)根，利用50μM MeJA處理天仙子發(fā)根，發(fā)現(xiàn)該啟動子受MeJA的誘導(dǎo)。對各個不同截短長度啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進行GUS染色及轉(zhuǎn)基因發(fā)

5、根的GUS染色石蠟切片分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子是根特異性啟動子。主要研究結(jié)果如下：
　　1.根據(jù)HnPMT基因5＇端非編碼區(qū)設(shè)計特異性引物，利用hiTALL-PCR的方法，克隆了長1207bp的HnPMT基因啟動子(KU981110)。利用啟動子分析網(wǎng)站在線預(yù)測，ATG位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游79bp處。在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-30/-25區(qū)有一個TATA-box（TATAAA），在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-254/-359區(qū)存在多個CAAT-box，

6、都是真核植物啟動子具有的特征元件。同時又發(fā)現(xiàn)了參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的元件，如CGTCA-motif，TGACG-mitif和 G-box；激素響應(yīng)元件如AuxRR-core；SA響應(yīng)元件如TCA-element；參與防御基因激活的調(diào)控元件，如MBS，TC-rich repeats，W-box，HSE，LTR.；光響應(yīng)元件如Box4，Box I site，ATCC-motif，GAG-motif。Gap-box，Sp1等，ROOTMOTIF

7、TAPOX1，OSE2ROOTNODULE，OSE1ROOTNODULE和NTBBF1ARROLB是與根特異性有關(guān)的順勢作用元件。
　　2.將克隆到的HnPMT最長啟動子（-1128/+79）、各缺失啟動子（-701/+79、-451/+79、-217/+79）及 G-box突變啟動子構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體 pCAMBIA1391Z載體上，產(chǎn)物命名為pCAM-HnPMT217、 pCAM-HnPMT451、 pCAM-HnPMT7

8、01、 pCAM-HnPMT1128、pCAM-HnPMT217-muG-box，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，轉(zhuǎn)化擬南芥和天仙子發(fā)根。成功獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株AP217、AP451、AP701、AP1128，轉(zhuǎn)基因天仙子發(fā)根 HR217、HR451、HR701、HR1128、HR217-muG-box，為后續(xù)進行該啟動子功能的研究提供試驗材料。
　　3.對天仙子植株的實時熒光定量結(jié)果表明，HnPMT基因主要在根中表達(dá)，葉片中幾乎不表達(dá)。進

9、一步對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行GUS組織化學(xué)染色，分析結(jié)果表明：AP217、AP451和AP701的組織化學(xué)染色，該三種不同長度的啟動子驅(qū)動的報告基因GUS，在擬南芥的葉片和根中都有表達(dá)，沒有表現(xiàn)出組織特異性，AP1128的染色結(jié)果表明-1128/+79區(qū)段的啟動子能夠驅(qū)動報告基因GUS特異的在根中表達(dá)，而在葉片不表達(dá)。因此，HnPMT啟動子特異性在根中表達(dá)，并且在啟動子-1128/-701區(qū)之間存在根特異性元件。對天仙子發(fā)根的GUS組織化學(xué)染

10、色和石蠟切片的分析：在所有的轉(zhuǎn)基因發(fā)根中，發(fā)根的根尖和表皮層部位都沒有GUS的表達(dá)，HR217、HR451和 HR701發(fā)根中該三種長度的啟動子驅(qū)動的報告基因GUS，在根的皮層、內(nèi)皮層和維管組柱表達(dá)，HR1128發(fā)根GUS切片結(jié)果表明-1128/+79區(qū)段的啟動子能夠驅(qū)動報告基因GUS，在天仙子發(fā)根的內(nèi)皮層和維管柱表達(dá)，而在皮層不表達(dá)。因此推斷，在 HnPMT啟動子的-1128/-701區(qū)段有某些作用元件調(diào)控這一現(xiàn)象。
　　4.對

11、在三角搖瓶培養(yǎng)了28天的天仙子空白發(fā)根用50μM MeJA處理，分別處理0h、1h、6h、12h、24h，實時熒光定量分析不同處理時間點HnPMT基因的相對表達(dá)量，結(jié)果表明在24h，基因?qū)?0μM MeJA的響應(yīng)最厲害，此時間點基因的表達(dá)量最高。用同樣的方法處理轉(zhuǎn)基因發(fā)根，處理24h后測定報告基因GUS的相對活性，結(jié)果表明：HR217、HR451、HR701、HR1128轉(zhuǎn)基因發(fā)根都受到MeJA的誘導(dǎo)，因此HnPMT啟動子是一個受MeJ