TGFβ1基因codon10基因多態(tài)性對肝臟細胞功能的影響.pdf

1、目的：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤致死原因中位列第三。肝炎病毒、黃曲霉毒素、酒精、飲水污染和遺傳因素都是肝細胞癌的主要病因，其中最重要的一個病因是乙肝病毒(hepatitis Bvirus，HBV)或丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)的慢性感染。慢性乙型肝炎(chronichepatitis B，CHB)是一種最常見的高發(fā)病率和高死亡率的

2、傳染性肝病。全球乙肝病毒感染者約有20億，其中乙肝病毒攜帶者約為3.5億，每年大約有一百萬人死于HBV感染繼發(fā)的肝衰竭、肝硬化和肝癌。我國是乙肝的高發(fā)地，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，HBsAg陽性者占總?cè)丝诘?.18％，約1.2億人。其中慢性乙型肝炎患者約2000-3000萬人。作為乙肝主要不良結(jié)局的肝纖維化/硬化和原發(fā)性肝癌同樣具有較高的發(fā)病率，以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積為特征的肝纖維化是急、

3、慢性肝病的主要病理轉(zhuǎn)歸，且早期具有可逆性，但如果得不到及時診斷和治療，就可進一步發(fā)展成為肝硬化，肝功能可從代償走向失代償，患者最終因肝功能衰竭或并發(fā)肝癌而影響生存。
　　 肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝臟的間質(zhì)細胞，在慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。最新研究表明肝星狀細胞可以作為抗原提呈細胞，表達多種抗原提呈相關(guān)的重要分子，在肝臟相關(guān)的免疫功能中也發(fā)揮重要的作用。
　　

4、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)是強效致纖維化因子，介導(dǎo)細胞對組織的損傷，在纖維硬化性疾病中能激活纖維形成細胞，促進細胞外基質(zhì)產(chǎn)生，改變基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制劑的活性，增強靶細胞對細胞因子的反應(yīng)性，對肝炎、肝損傷后肝纖維化、肝硬化具有重要起始促進作用。TGFβ1至少存在10個以上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleo

5、tide polymorphism，SNP)位點，-509位點位于TGFβ1啟動子區(qū)域，codon10(Leu＞Pro)存在于TGFβ1前體分子的信號肽中，而信號肽中氨基酸序列的改變理論上可影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的分泌。我們設(shè)計相應(yīng)實驗檢測八種肝臟細胞系的TGFβ1基因-509位點的基因型及針對codon10(Leu＞Pro)的SNP對肝臟相關(guān)細胞功能的影響進行研究。
　　 方法：用PCR-RFLP方法檢測八種肝臟細胞系的TGFβ1基因

6、-509位點的基因型。構(gòu)建含codon10(Leu＞Pro)的TGFβ1(LAP+成熟態(tài)單體)真核表達重組體CMV-Leu、CMV-Pro。在L02、HepG2、SMMC-7721、LX-2細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體、CMV-Leu、CMV-Pro，培養(yǎng)24小時后，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清TGFβ1量。L02和HepG2細胞轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第12、24、36、48小時，分別進行MTF實驗，以檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對細胞增殖

7、情況的影響；L02和HepG2細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48小時，用Annexin V和PI進行雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。HepG2細胞轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后培養(yǎng)24小時，用CD105-FITC抗體對細胞進行標記，用流式細胞儀檢測CD105分子的表達情況。LX-2細胞轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后培養(yǎng)24小時，用CD80-FITC、CD83-PC5、CD1α-PE熒光標記抗體進行避光孵育，流式細胞儀檢測三種CD分子的表達情況。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0(Sta

8、tistical Package forthe SocialScience11.0)統(tǒng)計軟件用兩獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：確定了八種肝臟細胞系的TGFβ1基因-509位點和codon10的基因型。構(gòu)建的含codon10(Leu＞Pro)的TGFβ1(LAP+成熟態(tài)單體)真核表達重組體CMV-Leu、CMV-Pro通過測序確認序列正確。在四種細胞系中，分別轉(zhuǎn)染CMV-Leu、CMV-Pro組的TGFβ1分泌量比pc

9、DNA3.1組高，證明CMV-Leu、CMV-Pro能成功轉(zhuǎn)染進入細胞并能對其產(chǎn)生作用，提高其TGFβ1分泌量。轉(zhuǎn)染CMV-Pro組細胞的TGFβ1分泌量比轉(zhuǎn)染CMV-Leu組高，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在L02細胞凋亡實驗中，轉(zhuǎn)染CMV-Leu、CMV-Pro的凋亡率比轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的凋亡率低，其中轉(zhuǎn)染CMV-Pro的凋亡率又低于轉(zhuǎn)染CMV-Leu的凋亡率，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。在HepG2細胞的凋亡實驗中可以

10、發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CMV-Leu組和CMV-Pro組的細胞凋亡率顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組的凋亡率(P＜0.01)，其中轉(zhuǎn)染CMV-Leu組的細胞凋亡率又顯著高于轉(zhuǎn)染CMV-Pro組的凋亡率(P＜0.01)。在L02和HepG2細胞的細胞增殖實驗中，兩種細胞轉(zhuǎn)染CMV-Pro組的細胞增殖活性都高于相應(yīng)的CMV-Leu轉(zhuǎn)染組。在HepG2細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、CMV-Leu、CMV-Pro后，轉(zhuǎn)染CMV-Pro組CD105表達率比轉(zhuǎn)染CM

11、V-Leu組高，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在LX-2實驗中，轉(zhuǎn)染CMV-Leu、CMV-Pro細胞的CD1α、CD80表達率并無明顯差異，轉(zhuǎn)染CMV-Pro組的CD83表達率明顯低于轉(zhuǎn)染CMV-Leu組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：TGFβ1基因codon10為Pro時比為Leu時更能促進細胞TGFβ1的分泌活性，并能增加HepG2細胞的CD105表達。TGF p1 codon10為Pro時比為Leu時更能