p27kip1基因多態(tài)性對前列腺癌細胞功能及前列腺癌預后的影響.pdf

1、研究背景
　　 前列腺癌在歐美國家中發(fā)病率居男性惡性腫瘤第一位[1]。但是，隨著人均壽命的延長，生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，我國的前列腺癌發(fā)病率、死亡率也不斷上升。在一些經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)尤為突出。以上海地區(qū)為例，在男性患者中，前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過了膀胱腫瘤和腎癌，躍居男性患者惡性腫瘤第五位，位居泌尿系腫瘤第一位[2]。前列腺癌可以從局灶性病變，向局部進展期和進展期發(fā)展。目前，前列腺癌的治療方案取決于疾病的分期，對于早期和局部進

2、展期患者可通過根治性前列腺切除或放射治療方法治愈。對于進展期和發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌可以用手術(shù)去勢或藥物去勢等雄激素剝奪治療.但是，最初18～24月大多數(shù)患者對雄激素剝奪治療反應良好，此后，一部份患者不可避免地出現(xiàn)血前列腺特異抗原(Prostatespecificantigen；PSA)升高，腫瘤重新生長，多處骨轉(zhuǎn)移等特征[3]。此時前列腺癌轉(zhuǎn)變?yōu)榧に氐挚骨傲邢侔?Hormonerefractoryprostatecancer；HRPC)[

3、4，5]。對于HRPC目前尚無理想治療方法。因此，對于前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，尤其是對其病程發(fā)展的研究是目前全世界的熱點。
　　 大量的研究表明，細胞增殖周期的失調(diào)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，尤其是Gl期啟動的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。P27蛋白是細胞周期素依賴激酶(Cyclin-dependentkinase；CDK)抑制因子(CDKI)家族的重要成員，具有調(diào)控細胞周期的作用，對細胞周期進行負調(diào)控[7]。P27主要

4、通過與細胞周期素(cyclin)結(jié)合來發(fā)揮對cyclin-CDK復合物的抑制作用。P27對周期素依賴激酶(CDK)有兩方面的抑制作用：一、p27能抑制已結(jié)合到cyclin并被激活的CDK活性；二、p27也可以通過抑制CDK的激活過程，最終抑制細胞周期Gl→S的轉(zhuǎn)變。目前認為P27是一個腫瘤抑制因子，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。P27的抑癌作用主要通過以下途徑：一、對細胞周期的負性調(diào)節(jié)作用。二、誘導細胞凋亡。三、誘導細胞分化。而大

5、量的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)p27蛋白水平降低[8，9]。說明P27蛋白水平的下降與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是其具體機制尚不清楚。
　　 p27kipl基因在惡性腫瘤中很少發(fā)生突變，且與任何遺傳性腫瘤無關(guān)，但是Cave[10]等發(fā)現(xiàn)p27kipl基因多態(tài)性發(fā)生于第109密碼子的單核苷酸轉(zhuǎn)換，使氨基酸出現(xiàn)纈氨酸(Val)改變?yōu)楦拾彼?Gly)。這種多態(tài)性在腫瘤患者中占11％～26％，但也見于大約39％的正常人和癌旁組織。在

6、keibel[11]等的研究中研究了p27kipl基因Val109Gly多態(tài)性與前列腺癌發(fā)病風險的相關(guān)性。96例晚期晚期前列腺癌患者中，VV純和子67例(70％)，VG雜和子24例(25％)，GG純和子5例(5％)，經(jīng)統(tǒng)計學分析證實，p27kipl基因第109密碼子多態(tài)性與晚期前列腺癌的易感性相關(guān)。VV基因型患者更易患激素抵抗型前列腺癌(OR=2.11，95％CI=1.05-4.22)。但是到目前為止，有關(guān)p27基因多態(tài)性與前列腺癌相關(guān)

7、性研究的報道較少。
　　 目前越來越多的研究表明，人類基因組的多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切的聯(lián)系。同一條基因的不同基因型在不同的腫瘤組織中可以起完全相反的作用。p27kipl作為一個重要的腫瘤抑制因子，在調(diào)控細胞周期，誘導細胞凋亡和分化中均起重要作用，因此，p27kipl的多態(tài)性很有可能影響前列腺癌的進展和預后。但是目前缺乏對于p27kipl這種多態(tài)性與前列腺癌腫瘤的進展和預后相關(guān)性的研究。本課題擬通過體外實驗，詳細研究p2

8、7kipl基因Val109Gly多態(tài)性與前列腺癌細胞周期調(diào)控及凋亡的關(guān)系。同時通過與臨床資料相結(jié)合，明確p27kipl基因Val109Gly多態(tài)性是否影響前列腺癌患者的進展和預后。
　　 第一部分人類p27基因突變體的真核表達載體構(gòu)建
　　 [研究目的]
　　 為了研究p27基因Val109Gly多態(tài)性，我們利用點突變技術(shù)構(gòu)建了p27基因突變體的真核表達載體質(zhì)粒。
　　 [材料和方法]
　　 我們

9、以pcDNA3.1-p27質(zhì)粒為模版，設計點突變引物，采用碧云天生產(chǎn)的D0206基因定點突變試劑盒，根據(jù)該試劑盒protocol操作。產(chǎn)物測序，克隆擴增。
　　 [結(jié)果]
　　 我們成功地構(gòu)建了p27突變體真核表達載體p27(G/G)，該載體可在前列腺癌細胞內(nèi)高效表達。將該質(zhì)粒與野生型pcDNA3.1-p27(V/V)分別轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞系LNCaP細胞和PC3細胞，我們可以系統(tǒng)研究p27基因多態(tài)性對p27在前列腺癌細胞

10、中功能的影響。
　　 [結(jié)論]
　　 成功構(gòu)建了p27突變體真核表達載體p27(G/G)。
　　 第二部分p27基因多態(tài)性對前列腺癌細胞增殖影響的研究
　　 [研究目的]
　　 通過對轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(空質(zhì)粒，野生型pcDNA3.1-p27(V/V)，突變型pcDNA3.1-p27(G/G))的前列腺癌細胞進行增殖指標的檢測，分析基因多態(tài)性對p27抗增殖效應的影響。
　　 [材料和方法]
　

11、　 用空質(zhì)粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G)分別轉(zhuǎn)染PC3和LNCaP細胞，以空質(zhì)粒組為對照組。分別在0h，24h，48h，72h時間點用MTT方法檢測細胞增殖。
　　 [結(jié)果]
　　 MTT分析發(fā)現(xiàn)，在24h時間點，與對照組相比，野生型pcDNA3.1-p27(V/V)組與突變型pcDNA3.1-p27(G/G)組對兩種細胞增殖均有明顯抑制作用(p<0.05)。但野

12、生型組與突變型組之間無明顯差異。在48h時間點，野生型pcDNA3.1-p27(V/V)與突變型pcDNA3.1-p27(G/G)組與對照組相比存在差別(p<0.05)，而且，突變型組的抑制效果強于野生型組。在72h時間點差異更明顯。在PC3細胞和LNCaP細胞兩者之間，結(jié)果相似，無明顯差異。
　　 [結(jié)論]
　　 在48h和72h時間點突變型pcDNA3.1-p27(G/G)組對前列腺癌細胞增殖的抑制作用強于野生型pc

13、DNA3.1-p27(V/V)組。
　　 第三部分p27基因多態(tài)性對LNCap細胞周期影響的研究
　　 [研究目的]
　　 通過對轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒(空質(zhì)粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G))的前列腺癌細胞進行細胞周期檢測，分析p27基因多態(tài)性對前列腺癌細胞周期影響。
　　 [材料和方法]
　　 用空質(zhì)粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型

14、pcDNA3.1-p27(G/G)分別轉(zhuǎn)染PC3和LNCaP細胞，在24h，72h時間點分別收集細胞，用流式細胞儀(PI染色法)檢測各組細胞周期分布。用westen-blot檢測周期蛋白的表達情況。
　　 [結(jié)果]
　　 在24h時間點，野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G)轉(zhuǎn)染組與對照組相比，G0/G1期細胞比例升高，S期和G2/M期比例相對下降，但是野生型pcDNA3.1-

15、p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G)兩組無明顯差異。在72h時間點，野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G)組與對照組相比，G0/G1期比例升高，存在差異差異(p<0.05)，而野生型pcDNA3.1-p27(V/V)組突變型pcDNA3.1-p27(G/G)組之間也存在顯著差異。
　　 [結(jié)論]
　　 p27可使前列腺癌細胞周期阻滯在G0/G1期，但是突變

16、型pcDNA3.1-p27(G/G)比野生型pcDNA3.1-p27(V/V)阻滯效果更強。p27基因多態(tài)性對P27阻滯細胞周期的作用有影響，這種影響在LNCaP細胞和PC3細胞中無明顯差異。
　　 第四部分p27基因多態(tài)性對PC3細胞凋亡及其凋亡相關(guān)蛋白影響的研究
　　 [研究目的]
　　 通過對不同時間點，轉(zhuǎn)染(空質(zhì)粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G))的前列

17、腺癌細胞的細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白進行檢測，分析p27基因多態(tài)性對前列腺癌細胞凋亡影響及影響凋亡的機制作初步探討。
　　 [材料和方法]
　　 用空質(zhì)粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G)分別轉(zhuǎn)染LNCaP細胞和PC3細胞，在24h，72h時間兩個時間點收集細胞。用AV+PI雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。同時，用westernblot方法檢測各組24h，72h時間兩個時間

18、點的凋亡相關(guān)蛋(bcl-2，bax，caspase-3，PARP)表達變化。
　　 [結(jié)果]
　　 在24h時間點，與對照組相比，野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G)組均引起LNCaP和PC3細胞凋亡率均增加。72h時間點，突變型pcDNA3.1-p27(G/G)比野生型pcDNA3.1-p27(V/V)更能引起明顯細胞凋亡效應。與流式細胞檢測調(diào)亡率結(jié)果一致的是，突變型pcD

19、NA3.1-p27(G/G)與野生型pcDNA3.1-p27(V/V)相比，bcl-2表達明顯增加，bax表達量上升，caspase-3表達被激活。
　　 [結(jié)論]
　　 野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突變型pcDNA3.1-p27(G/G)均可引起LNCaP和PC3細胞凋亡率增加，但是，與野生型pcDNA3.1-p27(V/V)相比，突變型pcDNA3.1-p27(G/G)更能引起細胞的凋亡，p27基因的多

20、態(tài)性對于p27誘導細胞凋亡的能力有影響。
　　 第五部分p27基因多態(tài)性對前列腺癌患者預后的影響
　　 [研究目的]
　　 了解亞洲人群中，前列腺癌患者中p27基因多態(tài)性分布狀況，p27基因多態(tài)性與前列腺癌易感性及預后的關(guān)系。
　　 [材料和方法]
　　 通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerasechainreaction-restricationfragmentlengthpo

21、lymorphismanalysis，PCR-RFLP)方法，對2006年至2008年于我院接受雄激素阻斷治療的67例前列腺癌患者及50名對照患者進行p27基因型分析。通過電話隨訪方式，了解是否發(fā)生激素抵抗與死亡，以此判斷預后。通過Fisher'sExacttest統(tǒng)計學方法了解p27基因多態(tài)性對前列腺癌預后的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 統(tǒng)計結(jié)果顯示，67例前列腺癌患者中V/V純和型57例(85％)，V/G雜合子5例(

22、7.5％)，G/G純合子5例(7.5％)。50例對照組患者中V/V純和型42例(84％)，V/G雜合子6例(12％)，G/G純合子2例(4％)。67例前列腺癌患者中激素非抵抗型共29例，激素抵抗型38例。29例激素非抵抗型中V/V純和型22例(76％)，V/G雜合子3例(10％)，G/G純合子4例(14％)。38例激素抵抗型患者中V/V純和型35例(92％)，V/G雜合子2例(5％)，G/G純合子1例(3％)。
　　 [結(jié)論]<