細胞色素P4501A1基因多態(tài)性與功能變化的初步研究.pdf

1、本研究運用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建野生型、單點變異和雙點變異型重組質(zhì)粒表達載體，并轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細胞(HLF)，建立起有效的細胞模型，探討變異型細胞模型對3-MC毒作用的影響，揭示CYP1A1血紅素結(jié)合區(qū)域氨基酸與其代謝功能關(guān)系。 主要研究內(nèi)容和方法： 一、野牛型CYP1A1 cDNA全長基因T載體的構(gòu)建和鑒定用TRIZOL試劑從人乳腺癌細胞株MCF-7中抽提總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成總cDNA；利用自行設(shè)計的兩對特異

2、性引物，采用巢式聚合酶鏈式反應(yīng)擴增CYP1A1基因的cDNA全長序列，通過T載體克隆，酶切和測序鑒定確證。 二、CYP1A1活性結(jié)構(gòu)域附近Thr<'461>→Asn<'461>、Ile<'462>→Val<'462>定點突變及T載體克隆自行設(shè)計含突變堿基(1504C→A，1506A→G)的兩對引物，采用重疊延伸PCR方法對野生型CYP1A1基因進行1504C→A單點和1504C→A/1506A→G雙點的定點突變，通過T載體克

3、隆、酶切鑒定和測序確證。 三、CYP1A1-Wt和CYP1A1-Asn<'461>，-Val<'462>真核表達載體的構(gòu)建及細胞模型建立將構(gòu)建的CYP1A1野生型和-Asn<'461>，-Val<'462>變異型T載體雙酶切，重組至真核表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒pBABE-neo載體上，通過PCR及BamHI/SalI雙酶切確證。利用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑盒，將構(gòu)建的野生型和變異型CYP1A1表達載體轉(zhuǎn)染至人胚肺成纖維細胞(HLF)，用

4、1000μg/ml G418篩選轉(zhuǎn)染細胞。用免疫蛋白印跡法(Western Blotting)檢測轉(zhuǎn)染細胞CYP1A1蛋白的表達，觀察比較轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞的生長形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、生長速度、軟瓊脂培養(yǎng)生長狀況等生物學(xué)特性，了解轉(zhuǎn)染細胞對人體正常細胞生物學(xué)特性的影響。 四、3-MC對CYP1A1 Asn<'461>及Val<'462>變異細胞模型作用的研究首先觀察0，0.1，0.5，2.5，12.5，72.5μmol/L 3-

5、MC對正常HLF細胞作用24h后CYP1A1蛋白表達和活性的影響，并確定轉(zhuǎn)染細胞的染毒劑量；用2.5μmol/L 3-MC對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細胞染毒24h，觀察CYP1A1蛋白表達量和活性，細胞微核率、核異常率。 研究結(jié)果： 一、野生型CYP1A1 eDNA全長基因T載體的構(gòu)建和鑒定根據(jù)Genebank中CYP1A1 mRNA序列設(shè)計兩對引物(P1/P2，P3/P4)，其中上游內(nèi)引物(P3)的5’端引入BamHI內(nèi)切酶

6、位點，下游內(nèi)引物(P4)5’端引入SalI內(nèi)切酶位點，確定擴增目的序列中沒有此兩個酶切位點。抽提培養(yǎng)的MCF-7細胞總RNA，電泳觀察完整性，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA；首先用P1/P2引物擴增出含目的片斷在內(nèi)的1703bp片斷，以此為模板，用P3/P4擴增出CYP1A1 cDNA全長1541bp的目的片斷。 將擴增產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH<,5α>，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒后，PCR擴增，得到預(yù)期的1.5

7、kb片斷。用BamHI和Sail對重組質(zhì)粒進行酶切分析，得到1.5kb和3.0kb片斷；測序結(jié)果與Genebank中CYP1A1基因cDNA序列比較，符合率達99.9﹪，證實插入的片斷為目的片斷。將此質(zhì)粒命名為“pGEM-T-CYPlAl”。 二、CYPlAl活性結(jié)構(gòu)域附近Thr<'461>→Asn<'461>、Ile<'462>→Val<'462>定點突變及T載體克隆根據(jù)人群研究的資料，確定CYP1A1 mRNA的1504、

8、1506堿基為突變的目標(biāo)堿基，設(shè)計兩對含1504、1506突變堿基的引物(Pt1/Pt2，Pt3/Pt4)與擴增目的片斷的引物(P3/P4)共組成了五對引物，應(yīng)用PCR技術(shù)先分別得到含單點Asn<'461>，雙點Asn<'461>/Val<'462>變異的1397bp上游片斷和177bp的下游片斷，以此上下游片斷為模板，采用P3/P4引物擴增得到含突變位點的全長CYP1A1 cDNA。擴增產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5<,5

9、α>，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒后，PCR擴增得到1.5kb片斷；用BamHI和Sail對重組質(zhì)粒進行酶切分析得到1.5kb和2.6kb兩個片斷，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒用T載體通用引物測序，結(jié)果與Genebank中CYP1A1基因cDNA序列比較，確證成功將目標(biāo)位點進行了單點1504C→A和雙點1504C→A/1506A→G突變。將此兩個質(zhì)粒分別命名為“pMD-T-Asn<'461>”和“pMD-T-Asn-T-Asn<'461>/Val

10、<'462>”。 三、CYP1A1-Wt和CYP1A1-Asn<'461>，-Val<'462>真核表達載體的構(gòu)建及細胞模型建立。 四、3-MC對CYP1A1 Asn<'461>/Val<'462>變異細胞模型作用的研究 1.3-MC對正常HLF細胞CYP1A1表達及EROD的影響3-MC可以誘導(dǎo)正常細胞表達CYP1A1蛋白，且有一定的劑量——效應(yīng)關(guān)系：3-MC可以增高HLF細胞EROD活性，各組方差檢驗

11、F=36.092，P<0.01；LSD檢驗，2.5μmol/L以上染毒組與對照組比，均P<0.05：存在明顯的劑量——效應(yīng)關(guān)系，r=0.850(P<0.05)。因此確定3-MC的2.5μmol/L濃度為轉(zhuǎn)染細胞染毒劑量。 2.轉(zhuǎn)染細胞CYP1A1蛋白表達及EROD活性的影響未轉(zhuǎn)染HLF和轉(zhuǎn)染的HLF細胞CYP1A1蛋白表達有差異(見三、1)。EROD活性的測定發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)染HLF細胞與空載體轉(zhuǎn)染細胞HLF-pBABE比差異無統(tǒng)

12、計學(xué)意義(P>0.05)；HLF-Wt和HLF-Asn<'461>/Val<'462>細胞EROD與HLF和HLF-pBABE細胞相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但HLF-Asn<'461>細胞的EROD與兩個對照組細胞相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)：HLF-Asn<'461>細胞的EROD與HLF-Wt比差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但HLF-Asn<'461>/Val<'462>細胞EROD顯著高于HLF-Wt(P

13、<0.05)。提示單點和雙點變異型基因轉(zhuǎn)染對HLF細胞代謝功能產(chǎn)生了不同影響。 3-3-MC對HLF-Asn<'461>和HLF-Asn<'461>/val<'462>細胞蛋白表達及EROD活性的影響3-MC對轉(zhuǎn)染細胞染毒24h后，野生型HLF-Wt與變異型HLF-Asn<'461>、HLF-Asn<'461>/Val<'462>細胞的CYP1A1蛋白表達沒有顯著性差異。轉(zhuǎn)染細胞染毒后HLF-Asn<'461>細胞EROD活性

14、比HLF-Wt低，兩者有顯著性差異(P<0.05)；HLF-msn<'461>/Val<'462>細胞EROD活性高于野生型HLF-Wt細胞(P<0.05)。提示Thr<'461>→Asn<'461>單點變異和Thr<'461>→Asn<'461>→Ile<'462>→Val<'462>雙點變異改變了HLF對3-MC的代謝。 4-3-MC對細胞微核率和核異常率的比較用2.5μmol/L 3-MC對野生型和變異型細胞染毒24h后