促紅細(xì)胞生成素與模型小鼠早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 目的：建立符合早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)病理特點(diǎn)的動(dòng)物模型，為研究該病的發(fā)病機(jī)制及治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：選擇7日齡(P7)C57BL/6J新生小鼠48只，分為正常空氣組和模型組，每組24只。正?？諝饨M小鼠在正?？諝猸h(huán)境中生長(zhǎng)至17日齡(P17)；模型組小鼠在氧濃度為75％的環(huán)境中生長(zhǎng)至12日齡(P12)，然后回到正?？諝猸h(huán)境中生長(zhǎng)至17日齡(P17)。采用視網(wǎng)膜鋪片ADP酶血管組織化學(xué)染色法觀察小鼠視網(wǎng)膜血

2、管化的情況(包括血管閉塞的情況和新生血管形成的情況)；將視網(wǎng)膜組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，通過(guò)計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目，定量反映小鼠視網(wǎng)膜新生血管的程度。所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：正?？諝饨M小鼠視網(wǎng)膜完全血管化，血管發(fā)育成熟，深淺兩層血管網(wǎng)形態(tài)清晰。模型組小鼠12日齡(P12)時(shí)可見大血管管徑變細(xì)，血管走行僵直，分支減少，出現(xiàn)大片無(wú)血管區(qū)；15日齡(P15)時(shí)大血

3、管呈節(jié)段性的擴(kuò)張與迂曲，出現(xiàn)新生血管；17日齡(P17)時(shí)新生血管大量形成，深淺兩層血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞。17日齡(P17)正?？諝饨M小鼠突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目?jī)H為(1.27±0.29)個(gè)，而模型組達(dá)到(38.9±3.72)個(gè)，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。 結(jié)論：該小鼠模型具有類似ROP的血管閉塞、血管無(wú)灌注區(qū)、新生血管形成等改變，制備過(guò)程較簡(jiǎn)便，重復(fù)性好、可定量研究，是研究。ROP比較合適的動(dòng)物模型。第二

4、部分 目的：從現(xiàn)代分子生物學(xué)的角度，分析新生小鼠視網(wǎng)膜正常發(fā)育及氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變過(guò)程中，促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，Epo)、促紅細(xì)胞生成素受體(Erythropoietin Receptor，EpoR)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)的基因調(diào)節(jié)規(guī)律及蛋白表達(dá)規(guī)律，闡明Epo和其受體在視網(wǎng)膜血管發(fā)育及ROP發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法：選擇7

5、日齡(P7)C57BL/6J新生小鼠96只，分為正常空氣組和模型組。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠視網(wǎng)膜上Epo、EpoR以及VEGF的mRNA水平，觀察其變化規(guī)律；運(yùn)用免疫組化法觀察不同時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠視網(wǎng)膜切片細(xì)胞胞質(zhì)中Epo、EpoR以及VEGF蛋白的表達(dá)情況，并檢測(cè)切片染色的平均灰度值以測(cè)定其蛋白表達(dá)水平。具體取材時(shí)間是：自P7起至P21隔天每組各取6只小鼠，小鼠左眼視網(wǎng)膜行RT-PCR，右眼行免疫組

6、化。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：在正?？諝饨M中，小鼠視網(wǎng)膜Epo mRNA自P7起表達(dá)水平逐漸上升，P9達(dá)到高峰，自P11起開始下降，并維持在較低水平表達(dá)至P21。小鼠視網(wǎng)膜EpoRmRNA自P7起逐漸下降，P15起維持在較低水平至P21。小鼠視網(wǎng)膜VEGFmRNA自P7起上升，P9達(dá)到高峰，P11起出現(xiàn)下降并始終維持在低水平表達(dá)。 在模型組中，小鼠視網(wǎng)膜Epo mRN

7、A表達(dá)水平自P7起開始下降，整個(gè)吸氧階段持續(xù)降低。至出氧箱后Epo表達(dá)量緩慢上升，自P15起顯著上升，并始終維持在較高水平的表達(dá)直至P21。小鼠視網(wǎng)膜EpoR mRNA自P7起上升，P11達(dá)到高峰，并始終維持在較高水平表達(dá)直至P21。小鼠視網(wǎng)膜VEGF mRNA自P9起顯著下降，且在整個(gè)吸氧階段呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)，P11達(dá)到最低。至出氧箱后表現(xiàn)為緩慢上升的狀態(tài)，于P15起顯著上升，P17到達(dá)高峰，并持續(xù)維持在較高的水平上表達(dá)直至P21。

8、Epo、EpoR和VEGF的蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)與其基因表達(dá)變化趨勢(shì)基本相同，但略晚于其基因水平的變化。 結(jié)論：Epo、EpoR及VEGF在視網(wǎng)膜正常發(fā)育和ROP發(fā)生發(fā)展中均起作用。第三部分 目的：用Epo對(duì)C57BL/6J新生小鼠的氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)研究，從治療角度闡述Epo在ROP發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法：選擇7日齡(P7)C57BL/6J新生小鼠96只，在75％的高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5天至12日齡(P

9、12)后再放至正?？諝庵酗曫B(yǎng)5天至17日齡(P17)，在不同的時(shí)間段腹部皮下注射不同劑量Epo或者生理鹽水(NS)或是加熱滅活的Epo作為對(duì)照，共分為16組。組1～組4每只小鼠Epo注射劑量為2500U/Kg。其中組1是正?？諝饨M小鼠，給藥時(shí)間段為P7-P17；組2～組4是模型組小鼠，給藥時(shí)間段分別為P7-P12、P12-P17和P15-P17。組5～組8每只小鼠Epo注射劑量為5000U/Kg。其中組5是正?？諝饨M小鼠，給藥時(shí)間段同組

10、1；組6～組8是模型組小鼠，給藥時(shí)間段同組2～組4。組9～組12每只小鼠Epo注射劑量為10000U/Kg。其中組9是正常空氣組小鼠，給藥時(shí)間段同組1；組10～組12是模型組，給藥時(shí)間段亦同組2～組4。組13是正?？諝饨M，組14是模型組，每只小鼠在P7-P17腹部皮下注射NS，劑量為0.05ml。組15是正?？諝饨M，組16是模型組，每只小鼠在P7-P17腹部皮下注射加熱滅活的Epo，劑量為5000U/Kg。各組小鼠均于17日齡(P17)

11、時(shí)取其左眼進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片ADP酶組織化學(xué)染色，取其右眼行視網(wǎng)膜組織切片常規(guī)HE染色。通過(guò)視網(wǎng)膜鋪片和切片結(jié)果觀察血管形態(tài)學(xué)改變、視網(wǎng)膜血管化情況和新生血管增生情況。所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0 forwindows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：(1)所有正?？諝饨M小鼠，無(wú)論注射何種劑量何種藥物，P17時(shí)視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果均顯示視網(wǎng)膜完全血管化，血管發(fā)育良好，兩層血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰。所有模型小鼠的視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果均顯示P17時(shí)有無(wú)血管區(qū)，同時(shí)伴

12、有不同程度的新生血管，局部出現(xiàn)血管閉塞或/和血管擴(kuò)張，淺層和深層血管網(wǎng)形態(tài)發(fā)生改變。但很難從形態(tài)學(xué)上比較各組之間的差異。(2)正?？諝饨M小鼠在注射Epo后，按照劑量從小到大，各組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目依次為：1.17±1.16，1.00±0.89，0.83±0.75，而NS組為1.33±0.52，加熱滅活Epo組為1.17±0.75，五組間兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。但與所有模型組結(jié)果相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0

13、.05)。在模型組小鼠中，注射Epo后各組視網(wǎng)膜切片中突破內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目都有所減少，與NS組相比有顯著差異(P<0.001)，與注射加熱滅活Epo組相比差異亦非常顯著(P<0.001)。(3)不同劑量Epo注射后結(jié)果顯示各組在P7-P12時(shí)間段給藥突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目最少，與P12-P17和P15-P17時(shí)間段相比差異有顯著意義(P<0.05)。 結(jié)論：在新生小鼠視網(wǎng)膜病變發(fā)病的早期(P7-P12)給予