促紅細(xì)胞生成素在小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育與新生血管增殖中表達(dá)的研究.pdf

1、研究目的：已知促紅細(xì)胞生成素(EPO)具有血管生成素活性，但其對(duì)眼血管生成的作用還不清楚。臨床研究表明外源性給予重組人促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)可能促進(jìn)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究通過(guò)建立氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變鼠模型，觀察內(nèi)源性EPO在視網(wǎng)膜血管發(fā)育和新生血管形成中的蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，并與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)規(guī)律相比較，以期初步研究EPO在ROP病變發(fā)展中的作用。 研究方法：健康生后7天

2、(P7)C57BL/6J幼鼠32只，隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和正常發(fā)育組。其中10只建立高氧誘導(dǎo)模型作為模型組；對(duì)照組10只和正常發(fā)育組12只于自然環(huán)境飼養(yǎng)；前兩組于生后12、17天各處死5只；正常發(fā)育組于生后9、12、15、18天各處死3只。采用視網(wǎng)膜鋪片和ADP(二磷酸腺苷酶)染色、病理切片常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法，分別觀察視網(wǎng)膜血管的改變、視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目及EPO和HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。Olympus顯微

3、攝像系統(tǒng)采集圖片，圖像分析軟件進(jìn)行蛋白的累積光密度(IOD)值測(cè)定。對(duì)IOD值進(jìn)行分析和比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS12.0軟件包處理。正常發(fā)育組不同時(shí)限的光密度值采用方差分析；模型組和對(duì)照組間采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)；同組兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)性分析。 研究結(jié)果： 1、視網(wǎng)膜新生血管分析ADP染色視網(wǎng)膜鋪片顯示：正常發(fā)育組和對(duì)照組隨著鼠齡的增加，視網(wǎng)膜完全血管化；模型組P12

4、時(shí)視網(wǎng)膜血管的中心區(qū)和中周部出現(xiàn)無(wú)灌注；P17時(shí)在中周部灌注區(qū)與無(wú)灌注區(qū)的連接處出現(xiàn)新生血管叢。HE染色也顯示模型組P12時(shí)視網(wǎng)膜周邊部血管淤滯，神經(jīng)纖維層存在血管閉鎖；P17時(shí)毛細(xì)血管于神經(jīng)纖維層和內(nèi)核層明顯增殖，并突破內(nèi)界膜進(jìn)入玻璃體內(nèi)，在視網(wǎng)膜前形成新生血管。 2、正常發(fā)育組不同時(shí)限視網(wǎng)膜EPO蛋白表達(dá)EPO的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀。在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及神經(jīng)纖維層可見(jiàn)EPO陽(yáng)性顆粒。正常組EPO隨視網(wǎng)膜血管發(fā)育

5、呈動(dòng)態(tài)表達(dá)，P9時(shí)其IOD值為8.52±0.92，P12有明顯升高，達(dá)到20.85±0.72，以后三個(gè)時(shí)段之間沒(méi)有明顯差異，持續(xù)在較高水平。 3、高氧誘導(dǎo)模型視網(wǎng)膜EPO蛋白表達(dá)對(duì)照組P12、P17視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及神經(jīng)纖維層可見(jiàn)EPO蛋白表達(dá)；模型組P12視網(wǎng)膜各層及內(nèi)界膜附近棕黃色顆粒明顯減少，P17可見(jiàn)EPO蛋白表達(dá)顯著增加，位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層及突破內(nèi)界膜的新生血管，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05

6、)。 4、高氧誘導(dǎo)模型視網(wǎng)膜HIF-1α蛋白表達(dá)HIF-1α的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色。對(duì)照組P12、P17及模型組P12視網(wǎng)膜各層及內(nèi)界膜附近未見(jiàn)HIF-1α陽(yáng)性顆粒。模型組P17可見(jiàn)HIF-1α蛋白表達(dá)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和突破內(nèi)界膜的新生血管，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5、EPO和HIF-1α蛋白表達(dá)相關(guān)性對(duì)模型組P17幼鼠視網(wǎng)膜EPO和HIF-1α兩種蛋白的IOD值進(jìn)行相關(guān)性分析。模型組P17的EPO和

7、HIF-1α蛋白的IOD值呈正相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論： 1.視網(wǎng)膜EPO蛋白表達(dá)與視網(wǎng)膜血管發(fā)育有一定的時(shí)空關(guān)系，我們推測(cè)EPO可能參與正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育過(guò)程。 2.EPO在模型組不同時(shí)間位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化與ROP的兩期病理變化相一致，我們推測(cè)EPO可能參與ROP視網(wǎng)膜新生血管增殖過(guò)程。 3.在視網(wǎng)膜新生血管增殖中EPO與HIF-1α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè)HIF-1α可能參與缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜新生血管