體外不同生長狀態(tài)牛晶狀體上皮細(xì)胞對藥物敏感性的差異研究.pdf

1、白內(nèi)障囊外摘除(ECCE)聯(lián)合人工晶體(IOL)植入是目前治療各種白內(nèi)障最有效的手段，但是該手術(shù)的并發(fā)癥后發(fā)性白內(nèi)障(PCO)可以嚴(yán)重的影響患者的術(shù)后視力。晶狀體上皮細(xì)胞(BLECs)的增生、分化和凋亡是后發(fā)性白內(nèi)障形成的重要原因之一，因此利用藥物抑制BLECs的增生、分化和凋亡是防治PCO的重要途徑之一。 因?yàn)樗幬锏淖饔脵C(jī)制不同，因此在眼內(nèi)產(chǎn)生的毒副作用也不同．如抗代謝藥物絲裂酶素在眼內(nèi)除了對殘留的晶狀體上皮細(xì)胞有抑制作用以外

2、，還對眼內(nèi)靜止的細(xì)胞如角膜內(nèi)皮有毒副作用，因而限制了其在臨床的應(yīng)用；而一些非抗代謝藥物如地塞米松在眼內(nèi)除了抑制殘留的晶狀體上皮細(xì)胞增生以外對其他的靜止的眼內(nèi)細(xì)胞沒有毒副作用，因此其在臨床上應(yīng)用廣泛。研究者一般通過動物實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)藥物的毒性作用。但是動物實(shí)驗(yàn)有其缺點(diǎn)：主要是動物個體差異比較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有精確性。 因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計的目的：在體外，通過用含不同濃度血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)BLECs細(xì)胞，使細(xì)胞分別處于快速生長狀態(tài)和相對靜止的狀態(tài)

3、，分別模擬術(shù)后眼內(nèi)殘留的晶狀體上皮細(xì)胞的生長狀態(tài)和角膜內(nèi)皮細(xì)胞以及小梁內(nèi)皮細(xì)胞的生長狀態(tài)。在體外，使藥物作用于不同生長狀態(tài)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來模擬藥物作用于眼內(nèi)各種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，以彌補(bǔ)動物實(shí)驗(yàn)的不足。 一、實(shí)驗(yàn)方法 1．不同血清濃度對牛晶狀體上皮細(xì)胞生長速度的影響 將細(xì)胞消化以后，制成單細(xì)胞懸濁液，按1：2傳代。分別裝入2個25ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)，血清濃度分別為20％和2％。觀察細(xì)胞的融合是時間。 2．不同細(xì)胞濃度對牛

4、晶狀體上皮細(xì)胞生長狀態(tài)的影響 消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4x104／ml和4x10S／ml。將細(xì)胞加入24孔板中，細(xì)胞濃度4x104／ml的孔加入含20％FBS的DMEM；細(xì)胞濃度4x10S／ml加入含20％FBS的DMEM。每天每種細(xì)胞濃度消化兩孔測量A值，共測9天。繪制細(xì)胞生長曲線。 3．體外不同生長狀態(tài)牛晶狀體細(xì)胞對藥物的敏感性差異實(shí)驗(yàn)-MTT比色法 取對數(shù)生長的牛晶狀體上皮細(xì)胞，用0．25％胰蛋白酶和0．0

5、2％EDTA消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104／ml和4×10S／mi接種于24空培養(yǎng)板，每空體積lml,有藥物實(shí)驗(yàn)四組和空白對照組。分別使細(xì)胞處于不同的生長狀態(tài)，然后加入實(shí)驗(yàn)藥物。第一組加入含20％FBS的DMEM，細(xì)胞貼壁后加入實(shí)驗(yàn)藥物；第二組加／N20％FBS的DMEM，貼壁72小時后加入實(shí)驗(yàn)藥物；第三組2％FBS的DMEM，細(xì)胞貼壁后加入實(shí)驗(yàn)藥物；第四組加／N20％FBS的DMEM，貼壁72小時后加入實(shí)驗(yàn)藥物。加入藥物

6、的濃度分別為：5．氟尿嘧啶為25、50、100ug／ml；絲裂酶素為0．25、0．5、lug／mi；肝素為200、400、800u／ml：地塞米松為100、200、400u／ml。各組藥物分別培養(yǎng)48小時后，加／NM'IT培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)基，再加入DMS0震蕩15min，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測吸光度A值。每個濃度設(shè)三個空，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．20％IflI清培養(yǎng)組與2％血清培養(yǎng)組之間，牛晶狀體上

7、皮細(xì)胞的融合時間有顯著性差異。含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細(xì)胞生長迅速，牛晶狀體上皮細(xì)胞生長融合所需要的時間較短。含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細(xì)胞生長緩慢，牛晶狀體上皮細(xì)胞生長融合所需要的時間較長。 2．不同細(xì)胞濃度對牛晶狀體上皮細(xì)胞生長狀態(tài)的影響 20％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細(xì)胞加入濃度為4x104／ml，在經(jīng)過2-3天的潛伏期后，進(jìn)入快速生長狀態(tài)，5-8天后基本

8、融合。2％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細(xì)胞加入的細(xì)胞濃度為4×105／ml。細(xì)胞基本處于靜止?fàn)顟B(tài)， 3．同一濃度的5一氟尿嘧啶和絲裂酶素，20％FBS貼壁72h組的抑制率顯著高于其他三組。20％FBS貼壁72h組和20％FBS貼壁組抑制率高于2％FBS貼壁72h組和2％FBS貼壁組的抑制率。各組細(xì)胞數(shù)量和對照組有顯著性差異。同一種藥物作用時，隨著藥物濃度增高，抑制率升高。5一氟尿嘧啶和絲裂酶素對于快速生長的細(xì)胞和生長

9、緩慢的細(xì)胞都有抑制作用并且對于快速生長細(xì)胞的抑制率明顯大于生長相對靜止細(xì)胞的抑制率。 4．同一濃度的肝素和地塞米松，20％FBS貼壁72h組的抑制率顯著高于其他三組。20％FBS貼壁72h組和20％FBS貼壁組抑制率高于2％FBS貼壁72h組和2％FBS貼壁組的抑制率。20％FBS貼壁72h組和20％FBS貼壁組細(xì)胞數(shù)顯著底于對照組；2％FBS貼壁72h組和2％FBS貼壁組細(xì)胞數(shù)量和對照組無顯著性差異。隨著藥物濃度增高，20％F

10、BS貼壁72h組和20％FBS貼壁組抑制率升高；2％FBS貼壁72h組和2％FBS貼壁組的抑制率沒有明顯變化。肝素和地塞米松對于快速生長的細(xì)胞有抑制作用，對緩慢生長的細(xì)胞沒有抑制作用。 三、結(jié)論 1．抗代謝藥物對于快速生長的細(xì)胞和緩慢生長的細(xì)胞都有抑制作用并且對于快速生長細(xì)胞抑制率明顯大于緩慢生長細(xì)胞的抑制率。非抗代謝藥物對快速生長狀態(tài)細(xì)胞有明顯的抑制作用而對緩慢生長的細(xì)胞沒有抑制作用。 2．本實(shí)驗(yàn)方法有望成為動