環(huán)孢霉素A對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞抑制的體外研究.pdf

1、目的：
　　 體外研究環(huán)孢霉素A(CsA)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEB-3)抑制，計(jì)算CsA對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度;定量測(cè)定PCNA基因在無CsA處理的對(duì)照組與CsA處理的實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)，進(jìn)一步探討CsA抑制人晶狀體上皮細(xì)胞增殖的分子作用機(jī)制，驗(yàn)證CsA與PCNA陽性細(xì)胞表達(dá)量的關(guān)系，為CsA修飾的IOL體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)來源于廣州中山醫(yī)科大學(xué)眼科中心的人晶狀體上皮細(xì)胞

2、株HLE B-3細(xì)胞。
　　 (1)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的測(cè)定觀察細(xì)胞增殖狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置10個(gè)細(xì)胞濃度梯度（0.125×104個(gè)/ml、0.25×104個(gè)/ml、0.5×104個(gè)/ml、1.0×104個(gè)/ml、1.5×104個(gè)/ml、2.0×104個(gè)/ml、2.5×104個(gè)/ml、3.0×104個(gè)/ml、3.5×104個(gè)/ml、4.0×104個(gè)/ml）。以2×104個(gè)/ml細(xì)胞密度種植96孔板，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予CsA刺激，

3、濃度為1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml、16ug/ml，作用時(shí)間24h、48h、72h，對(duì)照組無CsA刺激，作用時(shí)間24h、48h、72h。每組設(shè)2個(gè)平行復(fù)孔，重復(fù)3次。
　　 (2)PCNA基因的表達(dá)測(cè)定以1×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于24孔板，實(shí)驗(yàn)組給予CsA刺激，濃度1ug/ml，作用24h、48h，對(duì)照組無CsA刺激，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)PCNA基因的復(fù)制;應(yīng)用組織免疫學(xué)方法檢測(cè)PCNA陽性細(xì)胞

4、的表達(dá)。每組設(shè)2個(gè)平行復(fù)孔，重復(fù)3次。
　　 (3)RT-PCR結(jié)果應(yīng)用2-ΔΔCT統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析，免疫組織化學(xué)結(jié)果分別應(yīng)用PI及IPP.5.0圖像分析法。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 (1)在低濃度時(shí)(1ug/ml) CsA作用24h對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，作用48h對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)組與對(duì)

5、照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CsA作用24h，IC50=71.010±1.851μg/ml，Probit=-2.964+1.601x; CsA作用48h, IC50=25.529±1.407μg/ml,Probit=-1.363+1.969x; CsA作用72h, IC50=17.881±1.252μg/ml,Probit=-5.915+4.723x。CsA對(duì)HLEB-3細(xì)胞的抑制呈時(shí)間依賴性及濃度依賴性。
　　 (

6、2)RT-PCR測(cè)定，CsA1ug/ml作用24h PCNA表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，作用48h PCNA表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 (3)免疫組織化學(xué)測(cè)定，CsA1ug/ml作用24h、48h PCNA陽性細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中，作用24h差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);作用48h差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　

7、(1)CsA1ug/ml作用24h，不能對(duì)HLE-B3增殖的抑制產(chǎn)生有效作用;在持續(xù)作用至48h時(shí)，CsA能夠有效抑制HLEB-3細(xì)胞的增殖。CsA對(duì)HLEB-3細(xì)胞抑制呈時(shí)間依賴性;在有效抑制濃度(1ug/ml)下，CsA對(duì)HLEB-3的抑制呈濃度依賴性，其半數(shù)抑制率提高。
　　 (2)CsA能夠抑制PCNA基因的表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性。環(huán)孢霉素A能夠抑制PCNA蛋白的表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性。
　　 (3)CsA通過抑制抑