血管源性疾病新型防治藥物發(fā)現(xiàn)的研究.pdf

1、心腦血管疾病是當前危害人類健康的頭號殺手，其全球發(fā)病率在20～30％之間。心腦血管疾病的主要致病根源是血管的病變，多數(shù)心腦血管疾病可歸為血管性疾病。血管性疾病是多種病因的綜合結(jié)果，目前用于臨床治療的藥物種類很多，部分藥物已被臨床實踐證明具有良好的治療效果。但是，這些藥物往往需要病人終生服用，而且很多藥物經(jīng)過長期使用卻并未降低疾病的死亡率。因而新型血管性疾病防治藥物的發(fā)現(xiàn)一直是醫(yī)藥科學(xué)研究者們努力的方向。本論文在認識藥物靶點的基礎(chǔ)上，對靶

2、點藥理學(xué)作用進行適當評估，建立篩選模型，通過篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物。主要從以下幾方面開展防治血管性疾病新藥發(fā)現(xiàn)的研究： 一、糜酶的重組表達及其抑制劑的高通量篩選腎素-血管緊張素系統(tǒng)參與了各種血管性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。該系統(tǒng)中除了ACE以外，還有糜酶也能催化Ang I生成Ang II，構(gòu)成了Ang II生成最重要的旁路。近年來研究發(fā)現(xiàn)，糜酶在多種血管性疾病的發(fā)病過程中起了重要作用，它已經(jīng)成為一個重要的藥物靶點，但糜酶抑制劑尚處于臨床

3、前研究階段。倉鼠糜酶2與人糜酶同屬于α糜酶，兩者的蛋白序列同源性較高，目前關(guān)于糜酶的研究多數(shù)在倉鼠中進行。我們首先對倉鼠糜酶2基因進行了克隆，并分別在畢赤酵母和大腸桿菌兩個表達體系中對糜酶2進行了重組表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糜酶2在畢赤酵母中表達量很低，而在大腸桿菌中表達量極高，同時又證明了在大腸桿菌中表達的糜酶2具有水解Ang l為Ang II的活性。在成功表達糜酶2的基礎(chǔ)上，我們建立了糜酶抑制劑的高通量篩選模型，該模型具有快速、高效、穩(wěn)定的優(yōu)

4、點。應(yīng)用該模型，篩選樣品庫中40080個樣品，又對其中的807個樣品進行了復(fù)篩，最終發(fā)現(xiàn)了有52個化合物和102個中藥樣品具有抑制糜酶的活性，其中有兩個化合物的IC50在1μM以下。 二、尾加壓素II的血管效應(yīng)及其受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立尾加壓素II(UII)是迄今發(fā)現(xiàn)收縮血管活性最強的物質(zhì)，其受體即UII受體是最近發(fā)現(xiàn)的一種G蛋白偶聯(lián)受體。研究發(fā)現(xiàn)，UII在各種血管性疾病中扮演著極其重要的角色，已成為治療高血壓、動脈粥樣硬化等

5、血管性疾病的重要潛在靶點。我們對UII這一個新靶點的功能進行了初步研究首先考察了UlI對大鼠胸主動脈的收縮血管作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)給予UII刺激后，可出現(xiàn)明顯的脫敏現(xiàn)象，去除內(nèi)皮對脫敏現(xiàn)象無明顯影響，而NOS抑制劑L-NAME能夠顯著抑制UII的脫敏現(xiàn)象，該結(jié)果表明UIl的脫敏可能與血管平滑肌中NOS有關(guān)。隨后研究發(fā)現(xiàn)，在去除內(nèi)皮的血管中UII的脫敏能夠被iNOS抑制劑氨基胍所抑制，而nNOS抑制劑亞精胺則無效。最終確定UIl脫敏機制

6、與其激活血管平滑肌中iNOS的活性有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，又考察了UII對大鼠血管平滑肌細胞中各種血管損傷相關(guān)因子表達的影響。結(jié)果顯示，UII對血管平滑肌細胞的iNOS和VEGF的mRNA表達水平有很強的促進作用，而且UII促進VEGF表達的作用與自由基的生成有關(guān)。血管外膜在血管重構(gòu)過程中起了重要作用，研究結(jié)果表明UII能夠明顯促進外膜成纖維細胞表型向肌成纖維細胞改變。α平滑肌肌動蛋白的表達是外膜成纖維細胞表型改變的一個重要指標。UII(10

7、0 μM)作用48 h后，細胞中α平滑肌肌動蛋白表達顯著升高，而且其表達能夠被自由基清除劑所抑制，說明UII對外膜成纖維細胞表型的改變作用也與自由基有關(guān)。為了更好地了解UII受體的功能，我們又在哺乳動物細胞中重組表達了UII受體。從人基因組中成功克隆了UIl受體的基因，以pcDNA3.1(+)作為表達載體構(gòu)建了真核細胞表達質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CHO細胞中，經(jīng)過G418篩選，建立了UII受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。該細胞株的建立為UIl受體功能的

8、研究以及受體結(jié)合藥物的篩選提供了必要的物質(zhì)條件。 三、植物GL中收縮血管活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)GL是一個草本植物，民間用于高血壓的治療取得了很好的療效。本實驗室之前也在正常大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠上觀察到GL的提取物具有一定的降壓作用，但是在離體血管環(huán)實驗中非常意外地觀察到GL提取物具有很強的收縮血管活性。為了解釋其中的緣由，我們對GL中的血管活性物質(zhì)進行分離和鑒定。通過綜合應(yīng)用提取、分離、血管活性鑒定和化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定等方法，成功分離并鑒定

9、了GL中的收縮血管物質(zhì)，它是一個結(jié)構(gòu)全新的化合物。 四、匹諾塞林的舒張血管作用及其機制的研究天然產(chǎn)物是藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源之一，通過篩選，我們發(fā)現(xiàn)了具有舒張血管作用的天然產(chǎn)物匹諾塞林。5～100 μM匹諾塞林能夠呈劑量依賴性地舒張NE和KCI預(yù)收縮的大鼠胸主動脈，而且30 μM和50μM匹諾塞林對NE和KCI的收縮血管效應(yīng)也有明顯的抑制作用。匹諾塞林的舒張血管作用部分依賴于內(nèi)皮，NOS抑制劑和鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍能夠抑制它的舒

10、張血管作用，而環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛則沒有明顯的作用。在去除內(nèi)皮的血管環(huán)中，高濃度匹諾塞林的舒張血管作用能被鉀通道阻斷劑格列苯脲、TEA和4-AP所阻斷。在去除內(nèi)皮的血管環(huán)中，高濃度匹諾塞林也能夠明顯抑制無鈣KH液中NE引起的短暫收縮以及無鈣高鉀KH液中氯化鈣引起的血管收縮。本研究提示匹諾塞林既通過促進內(nèi)皮細胞釋放NO，激活cGMP通路引起血管舒張，也通過直接作用于血管平滑肌開放鉀通道、阻滯鈣通道發(fā)揮舒張血管作用。 本論文通過對