復(fù)方中藥抗腫瘤作用及其對鼻咽癌細胞微小RNA影響的研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，近半個世紀以來，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。癌癥患者中約70﹪～80﹪是中晚期，多數(shù)病人失去早期手術(shù)根治的機會，多以放療或化療為主，雖有一定的近期療效，但常因不良反應(yīng)嚴重等而未能明顯延長患者的生存期<'[1]>。 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)又稱“廣東癌”，是一種好發(fā)于東南亞特別是中國南方地區(qū)，來源于鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤。鼻咽部位復(fù)雜的解剖特點決定

2、了實施手術(shù)的極大危險性，目前臨床上NPC首選的療法放療雖幾經(jīng)改良或與化療等聯(lián)合應(yīng)用，但因其非特異毒性、放療耐受和遠處轉(zhuǎn)移等弊端嚴重制約NPC病人五年生存率的提高<'[2，3]>。 近年來，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，腫瘤的臨床與基礎(chǔ)研究取得了可喜的成就，特別是“綜合治療”理念的提出，為腫瘤臨床治療提供了更廣闊的空間。尤其是近年來中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的優(yōu)勢備受國內(nèi)外關(guān)注，已有實驗和臨床資料表明，中醫(yī)藥在提高腫瘤病人生活質(zhì)量，延長生存時間，降

3、低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面具有獨特的優(yōu)勢<'[4]>。因此，開發(fā)新的抗癌中藥和利用現(xiàn)代技術(shù)深入研究具有多種成分、多個作用靶點的中藥抗腫瘤作用機制具有重大意義和潛在性應(yīng)用前景。 復(fù)方中藥(Fu-Fang-Zhong-Yao，F(xiàn)FZY)是中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科的經(jīng)驗配方，在臨床應(yīng)用中顯示較好的抗腫瘤和改善病人生存狀態(tài)功效。但其抗腫瘤作用及其機制系統(tǒng)研究尚未見報道。因此，本研究采用體內(nèi)外實驗，按照抗腫瘤藥物藥效學(xué)研究指導(dǎo)原則，觀察FF

4、ZY對S<,180>和CNE-2荷瘤鼠腫瘤模型等的抗腫瘤作用，并從FFZY對癌細胞周期及凋亡和免疫功能的影響，特別是調(diào)控微小RNA(microRNA，miRNA)表達的角度探討其機制，旨在為FFZY的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。研究材料和方法： 1 主要實驗材料：FFZY按配方由廣州中醫(yī)藥大學(xué)專業(yè)人員熬制，每毫升含1克生藥的含揮發(fā)油浸膏，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；S<,180>、CNE-1及CNE-2細胞株和實驗動物購于中山大學(xué)實驗動物中

5、心； 2 FFZY抗腫瘤作用的體外研究方法： (1)急性毒性試驗：觀察1g生藥/mL FFZY浸膏對昆明小鼠的急性不良反應(yīng)，評價FFZY的安全性和確定抗腫瘤試驗的劑量范圍； (2)光鏡下細胞形態(tài)學(xué)觀察：體外培養(yǎng)的CNE-1和CNE-2細胞，經(jīng)濃度分別為10、5、2.5和1.25(mg/mL)的FFZY處理24 h或48 h，光鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化； (3)MTT法、SRB法和克隆形成實驗：檢測FFZY對

6、CNE-1和CNE-2細胞活性和增殖能力的影響，以反映FFZY的體外抗腫瘤活性； 3 FFZY抗腫瘤作用的體內(nèi)研究方法： 選用S<,180>昆明小鼠腫瘤模型和人低分化NPC細胞CNE-2的裸鼠移植瘤模型，評定FFZY對CNE-2細胞成瘤性的影響及對S<,180>和CNE-2荷瘤鼠移植瘤的治療效果； 4 FFZY抗腫瘤作用的機制探討方法： (1)流式細胞術(shù)和電鏡檢測：流式細胞術(shù)檢測不同劑量FFZY對CNE-

7、2細胞周期分布的影響；電鏡觀察經(jīng)FFZY治療的S<,180>荷瘤鼠瘤塊S<,180>細胞凋亡及脾和胸腺淋巴細胞增殖情況； (2)激酶試驗：分別選用濃度為5、2．5、1.25(mg/mL)的FFZY處理CNE-1和CNE-2細胞，檢測其對細胞周期素依賴性蛋白激酶2(CDK-2)激酶活性的影響； (3) MicroRNA芯片檢測：采用Paraflo microfluidic microRNA芯片，檢測激光掃描器收集雜交的圖

8、像，經(jīng)LOWESS濾器規(guī)范信號后比較數(shù)據(jù)，分析FFZY處理前后CNE-2細胞microRNA表達的差異。 研究結(jié)果： 1.FFZY體外抗腫瘤作用的研究結(jié)果： (1) FFZY的急性毒性：給藥30min后小鼠出現(xiàn)輕微活動減少，2小時左右后恢復(fù)正常，連續(xù)觀察7天，小鼠全身狀況、攝食、飲水、大小便和體重增長均正常，無動物死亡；7天后處死動物，解剖并肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，未發(fā)現(xiàn)異常改變； (2)

9、FFZY影響NPC細胞形態(tài)：CNE-1和CNE-2細胞經(jīng)不同劑量FFZY處理不同時間后，細胞變圓、脫落或出現(xiàn)明顯存活細胞數(shù)量減少，并且隨著FFZY劑量的增加細胞變化越明顯； (3) FFZY抑制NPC細胞活性和增殖：MTT和SRB試驗結(jié)果顯示，不同劑量的FFZY對CNE-1和CNE-2細胞活性均有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性；克隆形成實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著FFZY劑量的增加，細胞克隆形成數(shù)目減少，亦呈劑量依賴性；

10、結(jié)果提示FFZY可抑制體外培養(yǎng)的CNE-1和CNE-2細胞活性和增殖； 2 FFZY體內(nèi)抗腫瘤作用的研究結(jié)果： FFZY可抑制CNE-2在裸鼠體內(nèi)成瘤性，在S<,180>荷瘤小鼠和CNE-2荷瘤裸鼠兩種實驗動物腫瘤模型中顯示較好的體內(nèi)抑瘤作用； 3 FFZY體內(nèi)外抗腫瘤作用的機制 (1) FFZY提高荷瘤小鼠免疫功能：高、中及低濃度FFZY用藥可提高S<,180>荷瘤小鼠脾和胸腺系數(shù)，促進脾和胸腺淋巴細胞

11、增殖，且以高和中濃度治療組較明顯； (2) FFZY阻滯CNE-2細胞周期和誘導(dǎo)S<,180>細胞凋亡：流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)FFZY引起CNE-2細胞G0/G1期阻滯；電鏡檢測發(fā)現(xiàn)FFZY治療組S<,180>荷瘤鼠移植瘤組織中腫瘤細胞出現(xiàn)大量細胞凋亡表現(xiàn)； (3) FFZY降低NPC細胞CDK-2激酶活性：激酶試驗檢測發(fā)現(xiàn)當FFZY濃度為5mg/mL時明顯降低CNE-1細胞的CDK-2激酶活性，而FFZY濃度為1.25m

12、g/mL時明顯降低CNE-2細胞的CDK-2激酶活性； (4) FFZY影響低分化NPC細胞CNE-2的microRNA表達：microRNA表達譜芯片結(jié)果顯示FFZY處理CNE-2細胞后，在檢測的326個microRNA中，有10個microRNA明顯上調(diào)，1個microRNA明顯下調(diào)，其中檢測量的絕對值在1000以上且兩者相差log2(sampleB signal/SampleA signal)>1的microRNA有hsa

13、-miR-513，hsa-miR-498，hsa-miR-210和hsa-miR-602。 結(jié)論： 1、FFZY無急性毒性，在體外可抑制高低分化NPC的CNE-1和CNE-2細胞活性和增殖能力； 2、FFZY可抑制CNE-2細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性，在S<,180>荷瘤小鼠和CNE-2荷瘤裸鼠移植瘤模型中顯示較好的體內(nèi)抑瘤作用； 3、FFZY抗腫瘤作用機制通過提高荷瘤鼠脾和胸腺系數(shù)及促進脾和胸腺淋巴細胞增殖