3-溴丙酮酸對(duì)鼻咽癌細(xì)胞死亡的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1.3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate，3-BrPA)抑制人鼻咽癌細(xì)胞HNE1和CNE-2Z細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)死亡的作用。
　　2.3-BrPA作用于人鼻咽癌細(xì)胞是否通過(guò)活性氧(ROS)水平的變化引起細(xì)胞程序性壞死。
　　方法：
　　1.人鼻咽癌細(xì)胞HNE1及CNE-2Z經(jīng)過(guò)藥物處理后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；集落克隆法檢測(cè)藥物處理后細(xì)胞集落形成情況；不同濃度的3-BrPA處理人鼻咽癌細(xì)胞

2、HNE1及 CNE-2Z5h，用腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。
　　2. PI單染法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3-BrPA（0，80，160，320μM）作用于人鼻咽癌細(xì)胞 HNE1及 CNE-2Z細(xì)胞死亡率。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)檢測(cè)3-BrPA(0，40，80，160μM)作用于人鼻咽癌細(xì)胞 HNE1及CNE-2Z24 h后的細(xì)胞線粒體膜電位變化。
　　3.用Caspase抑制劑z-VAD-fmk（20

3、μM）或RIPK1抑制劑necrostatin-1（Nec-1，20μM）預(yù)處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1及CNE-2Z1h。預(yù)處理后，3-BrPA（160μM或320μM）聯(lián)合使用z-VAD-fmk（20μM）或Nec-1（20μM）。采用MTT法檢測(cè)存活率，來(lái)明確兩株細(xì)胞死亡形式；最后將HNE1和CNE-2Z用3-BrPA（160μM或320μM）處理后，用電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞器的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證兩株細(xì)胞HNE1和CNE-2Z的死亡形式

4、。
　　4. Western blot法檢測(cè)藥物處理人鼻咽癌細(xì)胞 HNE1及CNE-2Z對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。
　　5.人鼻咽癌細(xì)胞HNE1和CNE-2Z分別用3-BrPA(160μM或320μM)處理不同時(shí)間后，在細(xì)胞內(nèi)裝載超氧陰離子探針（DHE），采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ ROS）的含量變化情況；并用活性氧抑制劑 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC，5mM）預(yù)處理細(xì)胞1h，用NAC與

5、3-BrPA共同作用于細(xì)胞，繼而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的變化。最后，3-BrPA聯(lián)合NAC處理細(xì)胞，使用 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　6.在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。檢測(cè)移植瘤的生長(zhǎng)曲線， HE染色指標(biāo)觀察3-BrPA在體內(nèi)是否具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。
　　結(jié)果：
　　1.3-BrPA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HNE1和CNE-2Z增殖的影響
　　1.1采用MTT法檢測(cè)，分析量效曲線可知在3-BrPA作用后人

6、鼻咽癌細(xì)胞HNE1和CNE-2Z的增殖可以明顯被抑制。并且隨著3-BrPA作用于細(xì)胞的時(shí)間延長(zhǎng)和濃度的逐漸增加，細(xì)胞增殖抑制作用明顯增加。
　　1.2檢測(cè)3-BrPA對(duì)兩株細(xì)胞HNE1和CNE-2Z增殖作用的影響，首先根據(jù)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果選用低于細(xì)胞IC50的藥物濃度，觀察集落形成數(shù)目。結(jié)果可以得出：低劑量濃度的3-BrPA對(duì)HNE1和CNE-2Z具有增殖抑制作用。
　　1.3檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3-B

7、rPA(0，20，40，80，160，320μM)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)的ATP生成。
　　2.3-BrPA誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞死亡。
　　2.2用不同濃度的3-BrPA作用于人鼻咽癌細(xì)胞HNE1和CNE-2Z，PI單染法檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著3-BrPA濃度增加，細(xì)胞死亡率增多。
　　2.3 DAPI熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞核變化，結(jié)果顯示隨著3-BrPA濃度的增加細(xì)胞核呈現(xiàn)出濃縮致密，核裂現(xiàn)象逐漸增多。
　　3.3-BrPA

8、誘導(dǎo)線粒體膜電位發(fā)生變化。
　　3.1應(yīng)用熒光顯微鏡觀察JC-1染色后，人鼻咽癌細(xì)胞線粒體膜電位變化，給藥組同對(duì)照組的細(xì)胞相比較，可以觀察到紅色熒光逐漸向綠色熒光轉(zhuǎn)變。這表明細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位逐漸降低，細(xì)胞活性降低。
　　3.2通過(guò)Western blotting法檢測(cè)與有關(guān)蛋白 Mcl-1、Bcl-2、Bax及IAPs蛋白家族的變化，結(jié)果顯示：蛋白Mcl-1、Bcl-2以及IAPs蛋白家族CIAP1、 CIAP2、XIAP

9、表達(dá)減少，蛋白Bax的表達(dá)增多。
　　4. ROS產(chǎn)生在3-BrPA誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞死亡中的作用。
　　4.1將兩株細(xì)胞用3-BrPA處理，在顯微下觀察得熒光強(qiáng)度?？梢杂^察到細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高。
　　4.2檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度采用流式細(xì)胞儀。同空白組相比，3-BrPA作用不同時(shí)間段后，可以觀察到隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯增高。NAC和3-BrPA聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有明顯升高。
　　

10、4.3細(xì)胞存活率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明NAC（5mM）可以抑制3-BrPA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。表明3-BrPA是細(xì)胞內(nèi)ROS水平失衡而誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　5.3-BrPA誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生程序性壞死。
　　5.1 Caspase抑制劑z-VAD-fmk（20μM）與3-BrPA聯(lián)合使用后，HNE1和CNE-2Z的細(xì)胞存活率不受影響，而與RIPK1抑制劑Nec-1合用時(shí)，則發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率增加。
　　5.23-BrPA處理人鼻咽

11、癌HNE1和CNE-2Z后電鏡觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3-BrPA組細(xì)胞器膨脹，細(xì)胞呈空泡狀，具有程序性壞死的特征。
　　6.3-BrPA在裸鼠體內(nèi)抗腫瘤效果
　　6.1檢測(cè)3-BrPA體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，采用人鼻咽癌 CNE-2Z異種移植瘤裸鼠模型。裸鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線表明：3-BrPA組的腫瘤生長(zhǎng)曲線同空白組相比生長(zhǎng)曲線平緩腫瘤體積較小，但效果略差于順鉑（DDP）組。蘇木精-伊紅染色法（HE染色）結(jié)果表明，3-BrPA給藥組與空白