MMS2在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化過程中的作用.pdf

1、目的:
　　建立有效的脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染小分子干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，沉默大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)內(nèi)甲基磺酸敏感蛋白2(Methyl Methanesulfonate Sensitive2，MMS2)的表達(dá)，進(jìn)而探討MMS2在血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AⅡ)誘導(dǎo)NSCs向多巴胺(Dopamine，DA)能神經(jīng)元定向分化過程中的作用。

2、
　　方法:
　　(1)體外分離培養(yǎng)新生鼠大腦來源的NSCs，通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)其特異性標(biāo)志神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白((neuroepithelial stem cellprotein，Nestin)的表達(dá)和鑒定其多向分化潛能，即檢測(cè)NSCs分化細(xì)胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron special enolase，NSE)及2，

3、3-環(huán)核昔酸二脂酶(cyclic nucleotide phosphohydrolase，CNP)的表達(dá);
　　(2)將第二代的NSCs按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分成6組:A:對(duì)照組，B:AⅡ組，C:AT1受體拮抗劑ZD7155組，D:AT1受體拮抗劑ZD7155+AⅡ組，E:AT2受體拮抗劑PD123319組，F(xiàn):AT2受體拮抗劑PD123319+AⅡ組，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組NSCs內(nèi)MMS2mRNA的表達(dá);
　　(3)設(shè)計(jì)并化

4、學(xué)合成針對(duì)MMS2基因的3對(duì)siRNA分子序列，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSCs，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NSCs內(nèi)MMS2基因mRNA的表達(dá);
　　(4)按以上實(shí)驗(yàn)分組將轉(zhuǎn)染前后的NSCs誘導(dǎo)分化為DA能神經(jīng)元，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后誘導(dǎo)分化的各組細(xì)胞酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH) mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞，在NSCs專用培養(yǎng)基

5、中呈懸浮聚集式生長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)表達(dá)Nestin，其分化的細(xì)胞表達(dá)GEAP、NSE和CNP，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs且具備多向分化潛能;
　　(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)B組、D組細(xì)胞的MMS2基因表達(dá)水平明顯增高，分別是對(duì)照組的4.96倍和3.58倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而C、E和F組MMS2基因表達(dá)水平和對(duì)照組相比差異無顯著性差異(P＞0.05);
　　(3) MMS2-siRNA對(duì)大鼠NSCs內(nèi)MMS2基

6、因的沉默效果在轉(zhuǎn)染后36h達(dá)到最大抑制作用;3對(duì)特異性MMS2-siRNA序列均有效地抑制了MMS2基因的表達(dá)，沉默效率分別為siRNA_234(64±6)％、siRNA_346(84±3)％、siRNA_416(58±5)％，與空白對(duì)照組相比均存在顯著性差異(P＜0.05); siRNA_346沉默效率最高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究;
　　(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)未轉(zhuǎn)染的NSCs誘導(dǎo)分化10天后，B組和D組TH基因表達(dá)水平明顯

7、增高，分別是對(duì)照組的4.56倍和3.41倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而C、E和F組TH基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染MMS2-siRNA后的NSCs誘導(dǎo)分化10天后，各實(shí)驗(yàn)組的TH基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)體外分離培養(yǎng)的新生鼠腦細(xì)胞具備NSCs的生物學(xué)特性;
　　(2)靶向MMS2基因的siRNA分子片段可以有效地抑制NSC