MMS2在血管緊張素Ⅱ誘導神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化過程中的作用.pdf

1、目的:
　　建立有效的脂質(zhì)體瞬時轉染法，轉染小分子干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，沉默大鼠神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)內(nèi)甲基磺酸敏感蛋白2(Methyl Methanesulfonate Sensitive2，MMS2)的表達，進而探討MMS2在血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AⅡ)誘導NSCs向多巴胺(Dopamine，DA)能神經(jīng)元定向分化過程中的作用。

2、
　　方法:
　　(1)體外分離培養(yǎng)新生鼠大腦來源的NSCs，通過免疫細胞化學方法檢測其特異性標志神經(jīng)上皮干細胞蛋白((neuroepithelial stem cellprotein，Nestin)的表達和鑒定其多向分化潛能，即檢測NSCs分化細胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron special enolase，NSE)及2，

3、3-環(huán)核昔酸二脂酶(cyclic nucleotide phosphohydrolase，CNP)的表達;
　　(2)將第二代的NSCs按實驗設計分成6組:A:對照組，B:AⅡ組，C:AT1受體拮抗劑ZD7155組，D:AT1受體拮抗劑ZD7155+AⅡ組，E:AT2受體拮抗劑PD123319組，F(xiàn):AT2受體拮抗劑PD123319+AⅡ組，通過實時熒光定量PCR檢測各組NSCs內(nèi)MMS2mRNA的表達;
　　(3)設計并化

4、學合成針對MMS2基因的3對siRNA分子序列，采用陽離子脂質(zhì)體法瞬時轉染NSCs，運用實時熒光定量PCR檢測NSCs內(nèi)MMS2基因mRNA的表達;
　　(4)按以上實驗分組將轉染前后的NSCs誘導分化為DA能神經(jīng)元，通過實時熒光定量PCR方法分別檢測轉染前后誘導分化的各組細胞酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH) mRNA的表達。
　　結果:
　　(1)體外分離培養(yǎng)的細胞，在NSCs專用培養(yǎng)基

5、中呈懸浮聚集式生長，細胞團表達Nestin，其分化的細胞表達GEAP、NSE和CNP，表明分離培養(yǎng)的細胞為NSCs且具備多向分化潛能;
　　(2)實時熒光定量PCR法檢測B組、D組細胞的MMS2基因表達水平明顯增高，分別是對照組的4.96倍和3.58倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而C、E和F組MMS2基因表達水平和對照組相比差異無顯著性差異(P＞0.05);
　　(3) MMS2-siRNA對大鼠NSCs內(nèi)MMS2基

6、因的沉默效果在轉染后36h達到最大抑制作用;3對特異性MMS2-siRNA序列均有效地抑制了MMS2基因的表達，沉默效率分別為siRNA_234(64±6)％、siRNA_346(84±3)％、siRNA_416(58±5)％，與空白對照組相比均存在顯著性差異(P＜0.05); siRNA_346沉默效率最高，可用于后續(xù)實驗的研究;
　　(4)實時熒光定量PCR法檢測未轉染的NSCs誘導分化10天后，B組和D組TH基因表達水平明顯

7、增高，分別是對照組的4.56倍和3.41倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而C、E和F組TH基因表達水平與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05);轉染MMS2-siRNA后的NSCs誘導分化10天后，各實驗組的TH基因表達水平與對照組相比差異均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　(1)體外分離培養(yǎng)的新生鼠腦細胞具備NSCs的生物學特性;
　　(2)靶向MMS2基因的siRNA分子片段可以有效地抑制NSC