新型多肽神經組織工程支架材料及神經干細胞在其表面生長分化的實驗研究.pdf

1、目的：（1）建立小鼠乳鼠大腦皮質神經干細胞的分離、培養(yǎng)方法。 （2）鑒定神經干細胞及分化后的細胞，為神經干細胞的體內移植研究奠定基礎。 方法：體外分離出新生SD小鼠（出生1-3天內）的大腦皮質，機械吹打，采用無血清懸浮培養(yǎng)法，采用DMEM/F12培養(yǎng)基，添加B27，bFGF和EGF等生長因子，調整細胞密度至1×107/L，1×108/L，1×109/L，1×1010/L進行體外培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，取得具有自

2、我復制、增殖能力的細胞，并將細胞貼壁培養(yǎng)檢測其分化能力，應用多克隆兔抗鼠巢蛋白（Nestin）、多克隆兔抗鼠神經元特異性烯醇化酶（Neuron Specific Enolase NSE）、多克隆兔抗鼠膠質纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體，免疫組化鑒定細胞。 結果： （1）從新生小鼠大腦皮層組織分離出的細胞，在添加B27和EGF、bFGF的DMEM/F12的無血清

3、培養(yǎng)基中，可持續(xù)增殖，聚集成神經球。細胞經過貼壁后分化為神經元及神經膠質細胞，此法較簡單，為進行NSCs體內移植奠定了基礎。 （2）MTT實驗顯示按1×109/L密度培養(yǎng)細胞增殖最快，細胞數(shù)量從第3天起迅速增殖，于第7天達高峰。 （3）免疫細胞化學法呈現(xiàn)：抗Nestin陽性、抗NSE陽性，抗GFAP陽性。 結論：按上述方法分離、培養(yǎng)出的細胞具有自我復制、增殖及分化為神經元和膠質細胞的特性，屬于神經干細胞（NSCs

4、）。 目的：設計合成含IKVAV的新型組織工程多肽序列，研究其在不同條件下自組裝為多孔凝膠及生物力學特性。 方法：用傳統(tǒng)的固相法合成多肽（上海波泰生物科技有限公司），使用高效液相色譜儀（High performance liquid chromatograph，HPLC）測定純度，質譜儀（Mass spectrometer，MS）測定分子量；將合成的多肽粉末溶于0.1mol/LNaOH溶液中，配成10，2，1，0.5％wt

5、肽溶液，各取200ul肽溶液，加入等體積的DMEM/F12，涂于蓋玻片或置于10mol/L鹽酸蒸汽中，置入37℃干燥箱。使用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）及透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）檢測自組裝凝膠的結構，凝膠的流變學特性則使用血流計來測定。 結果：MS示肽的分子量為1351.72，HPLC示其純度為95％。多肽在DMEM/F1

6、2觸發(fā)下，數(shù)秒內形成凝膠；于10mol/L HCL蒸氣中，2小時后形成凝膠薄膜；在37℃恒溫干燥箱中，僅見白色肽粉末，未見凝膠；SEM檢測10％wt多肽自組裝凝膠由許多納米纖維構成，呈現(xiàn)多孔厚壁結構，TEM示：2，1，0.5％wt多肽自組裝凝膠是由相互交叉的編織狀納米纖維構成。1％wt多肽凝膠纖維直徑有3.5～5nm，長度95nm～1500nm；2％wt多肽凝膠納米纖維十分密集；0.5％wt肽凝膠納米纖維十分細，纖維間有較大的空隙；時間

7、掃描流變學示：損耗模量呈線性比存儲模量小，證實自組裝凝膠有一定生物力學強度，可支撐接種的細胞。 結論：本實驗設計合成了新型組織工程多肽，在DMEM/F12中可自組裝成多孔凝膠，成功合成了一種含IKVAV等活性區(qū)域的新型脊髓組織工程支架材料。 目的：體外分離培養(yǎng)出NSCS，接種于組織工程多肽自組裝多孔凝膠的表面，觀察NSCS在二維凝膠表面及其血清，聯(lián)合因子等條件下生長、分化情況。 方法：取小鼠乳鼠的大腦皮質，機械分離

8、，無血清懸浮培養(yǎng)出NSCS，用免疫細胞化學法，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶（Streptavidin biotin peroxidase Complex，SABC）檢測試劑盒鑒定細胞。多肽溶于NaOH溶液中，濃度為1％wt，PH=9.0，加DMEM/F12在蓋玻片上觸發(fā)多肽自組裝為凝膠，TEM檢測，實驗組：NSCS接種于二維凝膠的表面；對照組：NSCS接種于預先涂有多聚賴氨酸的蓋玻片表面；倒置相差顯微鏡觀察NSCS生長及分化情況，免疫

9、細胞化學染色，激光共焦顯微鏡觀察。 將NSCS球接種于用預先涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，在NSCS球貼壁后，按以下分組進行誘導分化：（1）5μ mol/ml Forskolin、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF200 ng/ml神經基因調節(jié)劑（HRG），聯(lián)合因子組；（2）10％血清，血清組；（3）20ng/ml bFGF，bFGF組。各組的培養(yǎng)基均為為DMEM/F12+B27添加劑。 用MAP2陽性細胞計數(shù)

10、分化的神經元，Hoechst33342陽性標記數(shù)來計數(shù)細胞總數(shù)。NSCS的神經元分化率=MAP2+細胞數(shù)/Hoechst33342標記細胞數(shù)。用圖像分析軟件對采集圖像中MAP2陽性的神經元的胞體面積、周長及細胞最長突起長度進行分析。 結果：免疫組化鑒定：無血清懸浮培養(yǎng)的細胞為NSCS，抗Nestin陽性。TEM示：凝膠為相互交織成網狀的納米纖維。實驗組：7天后，IPCM觀察到NSCS長出細長突起，對照組僅見未分化狀態(tài)的NSCS球

11、。LCM觀察：實驗組，NSCS發(fā)生分化，見神經元及星形膠質細胞，NF陽性，為較強紅色熒光，GFAP陽性，為弱綠色熒光；對照組：只見NSCS球，Nestin陽性，為綠色熒光。 聯(lián)合因子組：免疫熒光顯示：MAP2陽性細胞沿著S100陽性細胞的突起向外周移行，生長，分化，到誘導10d后，MAP2陽性細胞也出現(xiàn)許多突起，有部分呈現(xiàn)TH免疫陽性。 血清組：免疫熒光細胞化學染色見細胞呈S100強陽性，Hoechst33342染色見細

12、胞核較大，MAP2陽性細胞數(shù)量較少，胞體飽滿。 bFGF組：免疫熒光檢測：誘導3～5d后逐漸呈S100陽性，突起粗短。 結論：本課題采用機械分離，無血清懸浮培養(yǎng)出NSCS。TEM證實凝膠為網狀納米纖維。使用免疫細胞化學法進行細胞鑒定：凝膠對NSCS有較好的細胞相容性，NSCS在其表面可被誘導分化為神經元及神經膠質細胞。證實多肽自組裝二維凝膠可作為一種神經組織工程支架材料。NSCS在聯(lián)合因子和血清，bFGF條件下，生長分