Wnt-β-catenin信號途徑對鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化過程中作用的研究.pdf

1、背景與研究目的：神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)及體外培養(yǎng)，為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的治療提供了新的思路和方法。NSCs是具有多向分化潛能、自我復(fù)制、高度增殖能力等特點(diǎn)的多能干細(xì)胞，并能分化為特定類型神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。目前，關(guān)于NSCs的研究很多，但離臨床應(yīng)用尚有很大距離。新近研究表明，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后，在損傷局部移植NSCs能促進(jìn)成年動(dòng)物模

2、型的功能恢復(fù)，但移植的NSCs主要分化為膠質(zhì)細(xì)胞，形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙了神經(jīng)功能進(jìn)一步恢復(fù)，因此，探討NSCs準(zhǔn)確定向分化為神經(jīng)元的機(jī)制和技術(shù)成為脊髓損傷研究的熱點(diǎn)。NSCs的增殖分化受到自身基因及外來信號的共同作用。Wnt/β-catenin信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用，其與自身基因如bHLH、Notch信號通路及外來信號如TGF-β超家族成員(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和化學(xué)物質(zhì)(如維甲酸)等眾多因素的共同作用，

3、促進(jìn)了神經(jīng)的發(fā)育。研究表明，維甲酸能促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元定向分化，并與Wnt/β-catenin信號通路及其他信號間存在相互聯(lián)系，但機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本課題探討全反式維甲酸(ATRA)干預(yù)下，Wnt/β-catenin信號通路在鼠胚NSCs向神經(jīng)元定向分化中的作用及與其他信號因子的相互關(guān)系。 方法： 1.采用1×10<'4>/ml、1×10<'5>/ml、1×10<'6>/ml及1×10<'7>/ml接種密度體外培養(yǎng)鼠

4、胚NSCs，觀察細(xì)胞生長情況，MTT法檢測各密度培養(yǎng)的NSCs在不同時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞的增殖效應(yīng)，并繪制生長曲線；利用不同的傳代方法觀察亞代克隆的活性和增殖能力；使用免疫熒光染色法對神經(jīng)干細(xì)胞及其分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。選擇體外最佳的NSCs培養(yǎng)密度及傳代方法； 2.選用0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L、10.01xmol/L濃度的ATRA體外培養(yǎng)NSCs，使用BrdU免疫熒光染色，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，對比分析各組對細(xì)胞

5、增殖效應(yīng)；通過免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)檢測各組細(xì)胞分化為神經(jīng)元的能力，探索促神經(jīng)元分化的最佳ATRA濃度； 3.使用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和蛋白印跡(Western-Blot)分別檢測未干預(yù)及干預(yù)后3d、5d、7d、9d分化細(xì)胞的β-cmemn、CyclinD1、Axin、Wnt-1、Notch1、BMP2的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平；免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，觀察細(xì)胞內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)β-catenin、CyclinDl、Wn

6、t-1、Notch1、BMP2的表達(dá)及變化情況，探討ATRA干預(yù)下，鼠胚NSCs分化為神經(jīng)元過程中，不同時(shí)間點(diǎn)的’Wnt/β-catenin信號途徑及其相關(guān)信號因子的表達(dá)和相互作用。 結(jié)果： 1.從胚胎大鼠腦皮層成功分離培養(yǎng)出NSCs，在體外經(jīng)多次傳代后仍具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NSCs接種密度為1×10<'6>/ml時(shí)，細(xì)胞增殖速度最快，克隆球生成數(shù)量最多； 2.含有ATRA的完全培養(yǎng)基可促進(jìn)N

7、SCs增殖，各組間比較無明顯差別，但增殖能力明顯弱于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NSCs；1.0μmol/L的ATRA促神經(jīng)元分化比例最高，無ATRA的完全培養(yǎng)基中細(xì)胞主要分化為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞； 3.ATRA在促NSCs分化中，Wnt-1在細(xì)胞分化早期表達(dá)明顯增高，激活Wnt/β-cmemn信號通路，抑制β-catenin降解復(fù)合物重要成分Axin表達(dá)，促使β-catenin在細(xì)胞漿和細(xì)胞核表達(dá)增加，并增加靶基因CyclinD

8、l轉(zhuǎn)錄；同時(shí)，抑制了Notch1和BMP2蛋白的表達(dá)，表明，ATRA促神經(jīng)元分化的效應(yīng)可能與Wnt/β-catenin信號通路激活有關(guān)，并同時(shí)抑制Notch1及BMP2表達(dá)。 結(jié)論： 1．鼠胚NSCs細(xì)胞在體外可不斷增殖及傳代，1×10<'6>/ml接種密度是促進(jìn)NSCs增殖的最佳密度； 2．ATRA可促使NSCs增殖及分化，促增殖效應(yīng)弱于完全培養(yǎng)基，但能顯著促NSCs分化為神經(jīng)元，其中，1．0μmol/L濃度是