人Elafin基因重組轉(zhuǎn)染對氣道上皮完整性的維護(hù)作用.pdf

1、目的：構(gòu)建人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑Elafin(elastase-specificinhibitor)重組載體，探討其轉(zhuǎn)染表達(dá)對氣道上皮完整性維護(hù)的分子機(jī)制，為將重組Elafin用于臨床治療氣道慢性氣道炎癥性疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：(1)抽提人肺總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因片段，將其克隆于綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)表達(dá)載體pEGFP-C1上，經(jīng)酶切電泳、DN

2、A測序鑒定分析構(gòu)建是否成功。(2)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Elafin轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，將其與多形核粒細(xì)胞(polymorphonucleargranulocyte,PMN)共孵育，經(jīng)脂多糖(1ipopolysacc~de，LPS)刺激24h后，用Westembolt檢測細(xì)胞中緊密連接相關(guān)蛋白zonulaoccludens-1(ZO-1)表達(dá)、MTI'法測定細(xì)胞與膠原附著能力、底物法測定培養(yǎng)上清中中勝粒細(xì)胞彈f生蛋白酶(ne

3、utrophilelastase,NE)的活}生及ELISA檢測上清中Elafin的水平。1 結(jié)果：(1)經(jīng)PCR獲得459bp的產(chǎn)物，經(jīng)酶切、DNA測序，確定所擴(kuò)增片段為人Elafin基因cDNA，進(jìn)而成功篩選出表達(dá)載體pEGFP-Cl—Elafin，。轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞中有Elafin基因表達(dá)。(2)Westembolt發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激后，轉(zhuǎn)染空載體的A549細(xì)胞中ZO-1的表達(dá)明顯降低，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中ZO-1的表

4、達(dá)未見明顯降低。且MIT法發(fā)現(xiàn)LPS刺激后轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞與膠原附著能力明顯下降，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞與膠原的附著能力未見明顯下降。底物法測定培養(yǎng)上清中NE的活性發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NE活性與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比較明顯降低。ELISA檢測上清中Elafin的分泌情況顯示LPS刺激24h后，轉(zhuǎn)染Elafin+LPS組培養(yǎng)上清液中Elafin含量與未加刺激因素轉(zhuǎn)染Elafin的細(xì)胞相比較明顯降低。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒