CTNNAL1表達(dá)的應(yīng)答性調(diào)控及其在哮喘及氣道上皮中的作用.pdf

1、關(guān)于哮喘發(fā)病機(jī)制，氣道上皮缺陷理論已成為主流觀點(diǎn)之一。哮喘的病理特征之一表現(xiàn)為支氣管上皮損傷、脫落，提示哮喘患者的氣道上皮對(duì)損傷應(yīng)激的修復(fù)反應(yīng)可能出現(xiàn)缺陷。已知上皮細(xì)胞通過(guò)表達(dá)不同類型的粘附分子實(shí)現(xiàn)“粘附”和“錨定”是發(fā)揮正常功能的先決條件。國(guó)內(nèi)外及本實(shí)驗(yàn)室多項(xiàng)研究證實(shí)，粘附分子在氣道炎癥及損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。為了確定與哮喘易感性相關(guān)的粘附分子表達(dá)特征，本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中應(yīng)用基因芯片及生物信息學(xué)方法篩選了人外周血差異表達(dá)粘附分子

2、，發(fā)現(xiàn)連環(huán)素(catenin)家族中的CTNNAL1(catenin alpha-like1)基因在哮喘病人中表達(dá)下調(diào)。由于目前對(duì)于CTNNAL1功能意義的直接研究極少，其在支氣管上皮及肺組織中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題圍繞CTNNAL1與哮喘發(fā)病的關(guān)系、CTNNAL1對(duì)支氣管肺組織功能的影響及CTNNAL1基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了一系列研究。 方法與結(jié)果： 1)CTNNAL1與哮喘相關(guān)性分析 本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中應(yīng)用

3、基因芯片及生物信息學(xué)方法篩選了人外周血哮喘差異表達(dá)粘附分子，結(jié)果顯示多個(gè)基因表達(dá)水平改變。本研究選擇在所有哮喘病人中均下調(diào)的CTNNAL1(catenin alpha-like1)基因，應(yīng)用熒光定量RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果的可靠性；收集正常人及哮喘病人的支氣管粘膜，并構(gòu)建經(jīng)典的OVA致敏的小鼠哮喘模型，探討CTNNAL1在支氣管肺組織的分布情況及其與哮喘的關(guān)系。 熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示成年哮喘病人與正常成年人相比CTNN

4、AL1表達(dá)水平明顯降低。哮喘兒童病人CTNNAL1表達(dá)水平似比正常兒童低，但P>0.05，尚不能認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。 免疫組化和原位雜交顯示，CTNNAL1廣泛分布于支氣管柱狀纖毛細(xì)胞、細(xì)支氣管分泌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞。CTNNAL1在哮喘病人支氣管粘膜及哮喘模型小鼠的支氣管肺組織表達(dá)均下調(diào)，哮喘模型組小鼠氣道阻力顯著高于正常組，且CTNNAL1 mRNA水平與氣道阻力呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)

5、果證實(shí)CTNNAL1與哮喘發(fā)病相關(guān)。 2)CTNNAL1在氣道上皮中的生物學(xué)效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)利用吸入臭氧建立Balb/c小鼠支氣管肺組織應(yīng)激損傷模型。結(jié)果顯示，臭氧應(yīng)激導(dǎo)致明顯的杯狀細(xì)胞增生和上皮缺損。原位雜交實(shí)驗(yàn)和熒光定量RT-PCR顯示臭氧應(yīng)激可上調(diào)小鼠支氣管肺組織CTNNAL1 mRNA表達(dá)，于應(yīng)激的第二天達(dá)到高峰，但是隨著臭氧應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，CTNNAL1 mRNA表達(dá)緩慢下降。培養(yǎng)的人BEC細(xì)胞株爬片細(xì)胞原位雜交顯

6、示，未受臭氧應(yīng)激組BEC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，胞漿呈淺黃色，臭氧攻擊培養(yǎng)的人BEC30 min后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，染色明顯加深，呈深黃色。熒光定量RT-PCR結(jié)果與原位雜交一致。提示CTNNAL1參與BEC應(yīng)激反應(yīng)，其表達(dá)水平受應(yīng)激調(diào)控。 為闡明CTNNAL1在急性應(yīng)激下上調(diào)的功能意義，我們利用CTNNAL1表達(dá)質(zhì)粒和CTNNAL1反義寡核苷酸(ASO)建立CTNNAL1高表達(dá)或阻抑手段，籍此觀察CTNNAL1在氣道上皮中的生物學(xué)

7、作用。損傷修復(fù)測(cè)定采用機(jī)械損傷在融合的支氣管上皮細(xì)胞單層上造成一小面積不規(guī)則缺損，用顯微視頻分析系統(tǒng)每隔4h測(cè)量缺損面積一次，繪制時(shí)間與修復(fù)面積的直線回歸方程，直線的斜率為損傷修復(fù)指數(shù)，斜率越大，損傷修復(fù)速度越快。增殖采用MTT法。結(jié)果顯示CTNNAL1可促進(jìn)細(xì)胞的損傷修復(fù)和增殖。CTNNAL1 mRNA在損傷修復(fù)邊緣的活躍細(xì)胞高表達(dá)，有利于上皮細(xì)胞的修復(fù)。 我們還初步觀察了CTNNAL1在細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白(Fibrone

8、ctin，F(xiàn)n)激活與細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)有關(guān)的激酶中的作用。利用Western blot技術(shù)觀察到CTNNAL1 ASO單獨(dú)處理不影響FAK磷酸化，但CTNNAL1ASO處理可降低Fn促FAK磷酸化效應(yīng)，提示CTNNAL1在Fn促損傷修復(fù)與增殖效應(yīng)的FAK磷酸化途徑中發(fā)揮作用。 以上結(jié)果提示CTNNAL1參與維持氣道上皮的完整性，CTNNAL1表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致上皮功能缺陷及完整性破壞，從而與哮喘發(fā)病相關(guān)。我們認(rèn)為，急性應(yīng)激條件下CTN

9、NAL1表達(dá)上調(diào)是一種保護(hù)性應(yīng)答，哮喘病人可能出現(xiàn)了這種應(yīng)答機(jī)制的缺陷。 3)CTNNAL1基因表達(dá)調(diào)控研究 為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)CTNNAL1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，本研究對(duì)CTNNAL1的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)譜進(jìn)行篩選。利用啟動(dòng)子分析軟件PromoterScan和Transfac對(duì)CTNNAL1基因5’非編碼區(qū)進(jìn)行分析，推測(cè)啟動(dòng)子所在范圍在-552～-152 from ATG。TESS軟件(Transcription ElementSe

10、arch System)分析該區(qū)域內(nèi)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，據(jù)此設(shè)計(jì)8條探針，覆蓋所有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)用凝膠阻滯電泳(electrophoretic mobility shift assays，EMSA)篩選調(diào)控CTNNAL1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果顯示探針1，2，3，5，8有與蛋白結(jié)合形成的滯后帶，能被100倍未標(biāo)記探針?biāo)?jìng)爭(zhēng)，為特異性結(jié)合。通過(guò)突變探針結(jié)合試驗(yàn)、抗體超遷移試驗(yàn)，證實(shí)與探針結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子分別為L(zhǎng)EF-1、AP-2α和

11、CREB。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，LEF-1和.AP-2α可特異性與CTNNAL1啟動(dòng)子結(jié)合。 緊接著，我們用基因定點(diǎn)突變技術(shù)觀察LEF-1和AP-2α對(duì)CTNNAL1啟動(dòng)子活性的影響，結(jié)果顯示LEF-1與AP-2α的結(jié)合位點(diǎn)突變后，CTNNAL1啟動(dòng)子活性下降。 進(jìn)一步，我們用EMSA觀察到LEF-1與AP-2α在臭氧應(yīng)激30min后的活化情況，結(jié)果顯示臭氧應(yīng)激后LEF-1活化增加，在應(yīng)激后1h達(dá)到高峰，AF-2α的

12、活化發(fā)生在0-1h之間，于應(yīng)激后30 min達(dá)到高峰。CTNNAL1 nlRNA的表達(dá)與兩種轉(zhuǎn)錄因子的激活一致。提示在臭氧應(yīng)激條件下，LEF-1與.AP-2α特異性與CTNNAL1結(jié)合，共同調(diào)控CTNNAL1的表達(dá)。 結(jié)論： LEF-1與AP-2α特異性與CTNNAL1結(jié)合，共同調(diào)控CTNNAL1的表達(dá)。急性應(yīng)激條件下CTNNAL1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)與增殖，參與維持氣道上皮的完整性。CTNNAL1在哮