草莓病毒分子檢測(cè)及其部分基因組序列分析.pdf

1、Y762183分類(lèi)號(hào)韭點(diǎn)!』密級(jí)——博士學(xué)位論文草莓病毒分子檢測(cè)及其部分基因組序列分析楊洪一指導(dǎo)教師姓名————韭盎塞——堂盛L—一!噬武教援匡量型越援沈田盤(pán)些盍堂固藝堂瞳申請(qǐng)學(xué)蝴泓。越，。、專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)二—璺撾堂——一≤要茹≥蓍舸≥盤(pán)至i畜疊目語(yǔ)文替辯日期墊業(yè)生目目學(xué)位授予單位和日期—鹽壓籃些盍堂——當(dāng)塑芏L丘』!芝一答辯委員會(huì)主席衛(wèi)耍塹j乳_(kāi)控評(píng)聞人皿量塹j盟—撞韭丑查班宜雖昱亙望熬握昌塑耍熬援沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)二00五年六月摘要草莓是無(wú)性繁

2、殖的多年生草本植物，受多種病毒的侵染，病毒嚴(yán)重危害草莓生產(chǎn)。本論文旨在探索建立草莓幾種主要病毒的分子檢測(cè)技術(shù)體系，同時(shí)對(duì)病毒的部分基因組序列進(jìn)行分析。1草莓的核酸提取是進(jìn)行草莓分子生物學(xué)研究的難點(diǎn)。對(duì)不同核酸分離方法進(jìn)行了研究，結(jié)果表明硅捕獲法、改進(jìn)的硅捕獲法、Trizot法、PEX法、Release—IT法及上海生工、VGene、Invitrogen公司的RNA提取試劑盒未能從草莓中分離出高質(zhì)量的RNA。先利用磷酸鹽緩沖溶液研磨葉片，

3、再利用Qiagen試劑盒提取，可以有效地提取出草莓總RNA。而以CTAB緩沖液裂解組織，結(jié)合LiCI沉淀、酚／氯仿抽提，從草莓野生資源、栽培品種、昆諾藜中都可以提取出RNA，并可以穩(wěn)定地進(jìn)行ImPCR、多重R1二PCR、NASBA反應(yīng)。2建立了SMoV：SMYEV、SVBV的R1二PCR檢測(cè)體系。利用嵌套PCR對(duì)SMoV進(jìn)行了檢測(cè)，即首先利用第一對(duì)引物在低的退火溫度下擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，再利用第二對(duì)引物在高的退火溫度下擴(kuò)增，比常規(guī)RTPCR

4、提高靈敏度20倍左右。首次應(yīng)用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)檢測(cè)SMoV，比常規(guī)RTPCR提高靈敏度60倍左右。首次利用NASBA技術(shù)對(duì)SMoV迸行檢測(cè)，引物在SMoV基因組中位置同RTPCR引物相同，40℃反應(yīng)120min，檢測(cè)結(jié)果與R■PCR一致。3在利用常規(guī)RTPCR擴(kuò)增SMoV、SMYEV和利用嵌套PCR擴(kuò)增SMoV的研究中，試管苗都比田間苗有更低的檢測(cè)下限，意味著試管苗的病毒含量比罔間苗商。4為了監(jiān)測(cè)RNA的質(zhì)量和RTPCR的有效性，線粒體NA